Оценка кишечного трансцитоза изолятов бактериемии новорожденных Escherichia coli

Кишечная палочка является наиболее распространенной причиной раннего сепсиса у новорожденных ^1,2,3. Смертность от неонатальной бактериемии E. coli может достигать 40%, а менингит является возможным осложнением, которое связано с тяжелыми нарушениями развития нервной^{системы2}. Прием внутрь материнских штаммов кишечной палочки новорожденным может привести к неонатальной бактериемии; этот процесс был воспроизведен на животных моделях ^2,4. После попадания в организм патогенные бактерии перемещаются из просвета кишечника новорожденных через кишечный барьер и попадают в кровоток, вызывая септицемию. Неонатальные инвазивные штаммы E. coli, которые продуцируют бактериемию, различаются по своей способности вторгаться в эпителиальные клетки кишечника ^1,5. Однако их способность трансцитозировать эпителий кишечника после инвазии не была полностью охарактеризована.

Эта модель кишечного трансцитоза является полезным методом in vitro для эмуляции прохождения бактерий через эпителий кишечника. Общей целью методов, представленных в этой рукописи, является сравнение способности неонатальных изолятов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника. Модель, описанная здесь, использует клетки T84, которые являются увековеченными клетками аденокарциномы кишечника человека ^6,7. Клетки Т84 выращивают до слияния на полупроницаемой мембране с двумя отдельными отсеками. Обоснование использования этой техники заключается в том, что, как это происходит in vivo, эти клетки кишечника поляризуются и развивают зрелые плотные соединения ^6,8. Сторона, соприкасающаяся с мембраной, становится базальной. Противоположная сторона клеток становится апикальной стороной, напоминающей просвет кишечника, куда прилипают и вторгаются проглоченные патогены. Трансвелловая мембрана проницаема для бактерий, но поляризованные клетки кишечника образуют плотные соединения, которые ухудшают движение бактерий параклеток⁹. Таким образом, этот метод обеспечивает преимущество контролируемой среды in vitro с использованием клеточной линии человека для изучения процесса бактериального трансцитоза, включая трансклеточный путь. В то время как существуют другие методы исследования трансцитоза бактерий через эпителий кишечника, метод трансвелла, представленный здесь, обеспечивает большую легкость и доступность. Доступны альтернативные методы, такие как использование образцов ex vivo, установленных в системах камер Ussing. Тем не менее, они используют образцы тканей, которые могут быть недоступны, особенно если исследование направлено на изучение физиологии человека¹⁰. Кишечные органоиды представляют собой еще один пример альтернативы in vitro для изучения взаимодействия хозяина и бактерии¹¹. В то время как органоидные монослои также могут быть использованы в системе трансвелл для изучения бактериального трансцитоза, они требуют выделения и роста стволовых клеток и использования специфических факторов роста для индуцирования дифференцировки¹². Таким образом, их использование является более трудоемким и сопряжено с большими затратами по сравнению с методом трансвелла, описанным в данной рукописи.

Оценка прохождения бактерий через эпителий кишечника с использованием этой системы трансвелл in vitro была успешно выполнена для различных патогенов. Эти исследования показали полезность трансвелл-системы с использованием клеток Т84 для характеристики трансцитоза бактерий через поляризованный эпителий кишечника 13,14,15. Однако применение этого трансвелл-метода для сравнения трансцитозной способности неонатальных штаммов E. coli, продуцирующих бактериемию, подробно не описано. Эта рукопись предоставляет другим исследователям стандартный протокол трансвелла, который является надежным и простым в использовании и не требует слишком дорогих ресурсов.

Чтобы сравнить способность неонатальных инвазивных штаммов E. coli трансцитозировать эпителий кишечника, апикальная сторона монослоя эпителия кишечника может быть инфицирована известным количеством бактериальных клеток. После инкубации среда на базальной стороне эпителия может быть собрана, а бактерии количественно определены для определения количества бактериального трансцитоза с течением времени. В этой рукописи представленные методы используются для изучения трансцитозной способности неонатальных клинических штаммов E. coli, полученных от новорожденных, госпитализированных с бактериемией. Критерии включения для отбора этих неонатальных клинических изолятов для исследований трансцитоза были опубликованы ранее ^1,2,16. Когда этот метод выполняется с использованием различных штаммов кишечной палочки, можно сравнить их трансцитозные способности. Благодаря этому процессу модель кишечного трансцитоза предоставляет ценные данные для характеристики факторов вирулентности E. coli, которые способствуют многоступенчатому процессу, который завершается развитием неонатальной бактериемии.