In vitro Aufschluss von Emulsionen in einem einzigen Tröpfchen durch mehrphasigen Austausch simulierter Magen-Darm-Flüssigkeiten

Zu verstehen, wie Fett verdaut wird, was den Emulsionsaufschluss beinhaltet, ist wichtig, um Produkte mit maßgeschneiderter Funktionalität rational zu entwerfen¹. Das Substrat für die Fettverdauung ist eine Emulsion, da Fett beim Verzehr durch mechanische Einwirkung und Mischen mit Biotensiden in Mund und Magen emulgiert wird. Außerdem ist das meiste Fett, das vom Menschen konsumiert wird, bereits emulgiert (wie Milchprodukte), und im Falle von Säuglingen oder einigen älteren Menschen ist dies die einzige Form des Konsums. Daher ist das Design von emulsionsbasierten Produkten mit spezifischen Verdauungsprofilen in der Ernährung sehr wichtig¹. Darüber hinaus können Emulsionen Nährstoffe, Medikamente oder lipophile Bioaktiva² verkapseln und abgeben, um verschiedene gastrointestinale Erkrankungen wie Fettleibigkeit³, Nährstoffanreicherung, Nahrungsmittelallergien und Verdauungskrankheiten zu bekämpfen. In Öl-in-Wasser-Emulsionen sind Lipidtröpfchen von Grenzflächenschichten aus Emulgatoren wie Proteinen, Tensiden, Polymeren, Partikeln und Gemischen umgeben⁴. Emulgatoren spielen eine zweifache Rolle: Stabilisierung der Emulsion⁵ und Schutz/Transport der verkapselten Verbindung an eine bestimmte Stelle. Das Erreichen einer maßgeschneiderten Verdaulichkeit von Emulsionen hängt von ihrer ursprünglichen Zusammensetzung ab, erfordert aber auch die Überwachung der kontinuierlichen Entwicklung dieser Grenzfläche während des Transports durch den Magen-Darm-Trakt (Abbildung 1).

Abbildung 1: Anwendung der Grenzflächentechnik von Emulsionen zur Behandlung einiger der wichtigsten gastrointestinalen Erkrankungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Lipidverdauung ist letztendlich ein Grenzflächenprozess, da sie die Adsorption von Lipasen (Magen oder Pankreas) an die Öl-Wasser-Grenzfläche emulgierter Lipidtröpfchen durch die Grenzflächenschicht erfordert, um die im Öl enthaltenen Triglyceride zu erreichen und in freie Fettsäuren und Monoacylglyceride zu hydrolysieren⁶. Dies ist in Abbildung 2 schematisiert. Die Magenlipase konkurriert mit Pepsin und Phospholipiden im Magen um die Öl-Wasser-Schnittstelle (Abbildung 2, Magenverdauung). Dann konkurrieren Pankreaslipase / Colipase mit Trypsin / Chymotrypsin, Phospholipiden, Gallensalzen und Verdauungsprodukten im Dünndarm. Proteasen können die Grenzflächenabdeckung verändern und die Lipaseadsorption verhindern oder begünstigen, während Gallensalze sehr oberflächenaktiv sind und den größten Teil des verbleibenden Emulgators verdrängen, um die Lipaseadsorption zu fördern (Abbildung 2, Darmverdauung). Schließlich hängen die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Lipolyse von den Grenzflächeneigenschaften der anfänglichen/magisch verdauten Emulsion ab, wie z. B. der Dicke, inter- / intramolekularen Verbindungen sowie elektrostatischen und sterischen Wechselwirkungen. Dementsprechend bietet die Überwachung der Entwicklung der Grenzflächenschicht während ihrer Verdauung eine experimentelle Plattform, um Grenzflächenmechanismen und -ereignisse zu identifizieren, die die Lipase-Adsorption und damit die Lipidverdauung beeinflussen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Rolle von Grenzflächen bei der gastrointestinalen Lipidverdauung. Die Pepsinhydrolyse verändert die Grenzflächenzusammensetzung in der Magenphase, während die Magenlipase Triglyceride hydrolysiert. Im Dünndarm hydrolysieren Trypsin / Chymotrypsin den Grenzflächenfilm weiter, während die Lipolyse durch die Adsorption von BS / Lipasen, die Hydrolyse von Triglyceriden und die Desorption von lipolytischen Produkten durch Solubilisierung in den BS-Mizellen / -Komplex erfolgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Hängetropfenausrüstung an der Universität Granada (UGR) ist mit einer patentierten Technologie, der koaxialen Doppelkapillare, ausgestattet, die den Subphasenaustausch der Bulklösung⁷ ermöglicht. Die Kapillare, die den hängenden Tropfen hält, besteht aus einer Anordnung von zwei koaxialen Kapillaren, die unabhängig voneinander mit jedem Kanal eines Doppelmikroinjektors verbunden sind. Jeder Mikroinjektor kann unabhängig voneinander betrieben werden, was den Austausch des abgeworfenen Inhalts durch Durchlauf^{ermöglicht 7}. Dementsprechend besteht der Subphasenaustausch aus der gleichzeitigen Injektion der neuen Lösung mit der inneren Kapillare und der Extraktion der Bulklösung mit der äußeren Kapillare bei gleicher Durchflussrate. Dieser Prozess ermöglicht den Austausch der Bulk-Lösung ohne Störung des Grenzflächenbereichs oder des Volumens des Tröpfchens. Dieses Verfahren wurde später zu einem Multi-Subphasen-Austausch aufgerüstet, der bis zu acht sequentielle Subphasenaustausche der Tröpfchen-Bulk-Lösung⁸ ermöglicht. Dies ermöglicht die Simulation des Verdauungsprozesses in einem einzigen wässrigen Tröpfchen, das in lipidischen Medien suspendiert ist, indem die Bulk-Lösung sequentiell mit künstlichen Medien ausgetauscht wird, die die verschiedenen Kompartimente (Mund, Magen, Dünndarm) nachahmen. Das gesamte Setup ist in Abbildung 3 dargestellt, einschließlich der Details der Komponenten. Die Spritzen im Mikroinjektor sind mit den acht Vias-Ventilen verbunden, die jeweils mit einem Mikrozentrifugenröhrchen verbunden sind, das die künstliche Verdauungsflüssigkeit mit den in Abbildung 2 beschriebenen Komponenten enthält.

Abbildung 3: Gesamtansicht des OCTOPUS mit allen Komponenten. Die CCD-Kamera, das Mikroskop, der Mikropositionierer, die thermostabilisierte Zelle und die Doppelkapillare sind unabhängig voneinander mit einem Doppelmikroinjektor mit zwei Spritzen verbunden, die mit acht Vias-Ventilen verbunden sind. Jede Spritze ist mit Kapillare, vier Mikrozentrifugenröhrchen mit Probe und einem Austrag verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4A zeigt, wie jede der künstlichen Verdauungsflüssigkeiten durch Subphasenaustausch durch die Doppelkapillare in den hängenden Tropfen injiziert wird. Jede in Abbildung 2 beschriebene Verdauungsverbindung kann gleichzeitig/nacheinander angewendet werden, wodurch die Passage durch den Magen-Darm-Trakt simuliert wird. Die künstlichen Verdauungsflüssigkeiten enthalten verschiedene Enzyme und Biotenside, die die Grenzflächenspannung des Ausgangsemulgators verändern, wie in Abbildung 4B schematisiert. Die ebenfalls an der UGR entwickelte Software DINATEN (siehe Tabelle der Materialien) zeichnet die Entwicklung der Grenzflächenspannung in Echtzeit auf, wenn die erste Grenzflächenschicht in vitro aufgeschlossen wird. Außerdem wird nach jeder Verdauungsphase die dilatative Elastizität der Grenzflächenschicht berechnet, indem periodische Schwingungen des Volumens / der Grenzflächenfläche auf die stabilisierte Grenzflächenschicht aufgebracht und die Reaktion der Grenzflächenspannung aufgezeichnet wird. Die Periode/Frequenz und die Amplitude der Schwingung können variiert werden, und die Bildverarbeitung mit der Software CONTACTO liefert die dilatationsrheologischen Parameter⁸.

Abbildung 4: Beispiele für Verdauungsprofile . (A) Die anfängliche Emulgatorschicht wird künstlichen Verdauungsmedien ausgesetzt, die durch sequenziellen Subphasenaustausch der verschiedenen Lösungen in den hängenden Tropfen in die Mikrozentrifuge eingebracht werden. (B) Die allgemeine Entwicklung der Grenzflächenspannung (y-Achse) des Ausgangsemulgators als Funktion der Zeit (x-Achse), wie sie in vitro von den verschiedenen Enzymen/Biotensiden in den künstlichen Medien verdaut wird. Ein abschließender Subphasenaustausch mit reiner Darmflüssigkeit misst die Desorption von verdautem Lipid durch Solubilisierung in gemischten Mizellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diese Studie stellt das allgemeine Protokoll zur Messung der In-vitro-Verdauung von Grenzflächenschichten mit hängenden Tropfengeräten^{vor 9}. Die anfängliche Grenzflächenschicht wird nacheinander Bedingungen ausgesetzt, die die Passage durch den Magen-Darm-Trakt nachahmen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese verschiedenen Verdauungsmedien werden durch Subphasenaustausch der verschiedenen in den Mikrozentrifugenröhrchen enthaltenen Lösungen in den Pendeltropfen injiziert (Abbildung 4A). Die Zusammensetzung dieser Medien kann in Abhängigkeit von den zu bewertenden gastrointestinalen Bedingungen, nämlich Magen- / Darmproteolyse / Lipolyse, angepasst werden, was die Messung kumulativer Effekte und Sinergien ermöglicht¹⁰. Die experimentellen Bedingungen, die verwendet werden, um den Verdauungsprozess in jedem Kompartiment nachzuahmen, folgen dem von INFOGEST veröffentlichten internationalen Konsensprotokoll, das den pH-Wert und die Mengen an Elektrolyten und Enzymen detailliert beschreibt¹¹. Das experimentelle Gerät, das auf Pendant Drop basiert, ermöglicht die Aufzeichnung der Grenzflächenspannung in situ während des simulierten Verdauungsprozesses. Die dilatative Rheologie der Grenzflächenschicht wird am Ende jedes Verdauungsschritts berechnet. Auf diese Weise bietet jeder Emulgator ein Aufschlussprofil, das die Eigenschaften der aufgeschlossenen Grenzflächen veranschaulicht, wie in Abbildung 4B dargestellt. Dies ermöglicht die Extraktion von Rückschlüssen auf seine Anfälligkeit oder Resistenz gegenüber den verschiedenen Stadien des Verdauungsprozesses. Im Allgemeinen enthalten die künstlichen Verdauungsmedien sauren / basischen pH-Wert, Elektrolyte, Proteasen (Magen und Darm), Lipasen (Magen und Darm), Gallensalze und Phospholipide, die in ihren jeweiligen Verdauungsflüssigkeiten (Magen oder Darm) gelöst sind. Abbildung 4B zeigt ein generisches Profil der Entwicklung der Grenzflächenspannung eines Emulgators, der zuerst einer Proteasewirkung ausgesetzt wurde, gefolgt von Lipasen. Im Allgemeinen fördert die Proteolyse der Grenzflächenschicht eine Erhöhung der Grenzflächenspannung aufgrund der Desorption hydrolysierter Peptide^9,12, während die Lipolyse zu einer sehr starken Verringerung der Grenzflächenspannung aufgrund der Adsorption von Gallensalzen und Lipasen führt ¹³. Ein abschließender Subphasenaustausch mit Darmflüssigkeit verbraucht die Bulk-Lösung von unadsorbiertem/verdautem Material und fördert die Desorption löslicher Verbindungen und die Solubilisierung von verdauten Lipiden in gemischten Mizellen. Dies wird durch die erhöhte Grenzflächenspannung quantifiziert (Abbildung 4B).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das experimentelle Design, das im hängenden Tropfen implementiert wurde, um den In-vitro-Aufschluss in einem einzigen Tröpfchen zu simulieren, die Messung kumulativer Effekte und Synergien ermöglicht, wenn der Verdauungsprozess sequentiell auf die ursprüngliche Grenzflächenschicht¹⁰ angewendet wird. Die Zusammensetzung jedes Verdauungsmediums kann leicht abgestimmt werden, um den Besonderheiten der Verdauungsbedingungen Rechnung zu tragen, einschließlich gastrointestinaler Pathologien oder Verdauungsmedien für Säuglinge¹⁴. Dann kann die Identifizierung der Grenzflächenmechanismen, die die Proteolyse und Lipolyse beeinflussen, verwendet werden, um die Verdauung durch die Grenzflächentechnik von Emulsionen zu modulieren. Die erzielten Ergebnisse können bei der Entwicklung neuartiger Lebensmittelmatrices mit maßgeschneiderten Funktionalitäten wie geringer Allergenität, kontrollierter Energieaufnahme und verminderter Verdaulichkeit angewendet werden 15,16,17,18,19.