वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) -स्सिड इंटरल्यूकिन -2 गामा चेन रिसेप्टर (एनएसजी) चूहों पर मानव त्वचा को कैसे ग्राफ्ट किया जाए। प्रत्यारोपण के लिए मानव त्वचा की तैयारी, प्रत्यारोपण के लिए चूहों की तैयारी, विभाजित मोटाई वाली मानव त्वचा का प्रत्यारोपण, और प्रत्यारोपण के बाद की वसूली प्रक्रिया का विस्तृत विवरण रिपोर्ट में शामिल है।
मानव त्वचा जेनोग्राफ्ट मॉडल, जिसमें मानव दाता त्वचा को एक इम्यूनोडेफिशिएंट माउस होस्ट पर प्रत्यारोपित किया जाता है, त्वचा इम्यूनोलॉजी में ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण विकल्प है। म्यूरिन और मानव त्वचा शरीर रचना विज्ञान और प्रतिरक्षा कोशिका संरचना में काफी भिन्न होती है। इसलिए, पारंपरिक माउस मॉडल में त्वचाविज्ञान अनुसंधान और दवा की खोज के लिए सीमाएं हैं। हालांकि, सफल क्सीनट्रांसप्लांट तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं और ग्राफ्ट और मेजबान अस्तित्व के लिए इष्टतम नमूना और माउस ग्राफ्ट साइट तैयार करने की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों पर मानव त्वचा के प्रत्यारोपण के लिए एक अनुकूलित तकनीक प्रदान करता है और डाउनस्ट्रीम प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए आवश्यक विचारों पर चर्चा करता है। यह रिपोर्ट मानव दाता त्वचा के नमूने की उचित तैयारी, सर्जिकल सेटअप की असेंबली, माउस और सर्जिकल साइट की तैयारी, त्वचा प्रत्यारोपण और पोस्ट-सर्जिकल निगरानी का वर्णन करती है। इन विधियों का पालन सर्जरी के बाद 6 सप्ताह से अधिक समय तक जेनोग्राफ्ट्स के रखरखाव की अनुमति देता है। नीचे उल्लिखित तकनीकें इंजीनियरिंग नियंत्रण, बाँझ तकनीक और पूर्व और बाद की सर्जिकल कंडीशनिंग के विकास के कारण अधिकतम ग्राफ्टिंग दक्षता की अनुमति देती हैं। जेनोग्राफ्ट मॉडल के उचित प्रदर्शन के परिणामस्वरूप मानव त्वचा के प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन और विवो में यौगिकों के प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए लंबे समय तक जीवित रहने वाले मानव त्वचा ग्राफ्ट नमूने होते हैं।
माउस मॉडल का उपयोग अक्सर मानव जीव विज्ञान और बीमारी के बारे में निष्कर्ष निकालने के लिए किया जाता है, आंशिक रूप से उनकी प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता और आनुवंशिक हेरफेर की क्षमता के कारण। हालांकि, माउस फिजियोलॉजी मानव अंग प्रणालियों, विशेष रूप से त्वचा को पूरी तरह से पुन: उत्पन्न नहीं करता है, और इसलिए दवा के विकास में प्रीक्लिनिकल मॉडल के रूप में उपयोग के लिए सीमाएंहैं। माउस और मानव त्वचा के बीच शारीरिक अंतर में उपकला मोटाई और वास्तुकला में अंतर, मुराइन एक्क्राइन पसीने की ग्रंथियों की कमी और बालों के साइकिल चलाने में भिन्नता2 शामिल हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली की जन्मजात और अनुकूली भुजाएं दोनोंदो प्रजातियों के बीच भिन्न होती हैं। माउस त्वचा में डेंड्राइटिक एपिडर्मल टी कोशिकाओं (डीईटीसी) की एक अनूठी प्रतिरक्षा आबादी होती है, इसमें त्वचीय टी कोशिकाओं की अधिक प्रचुरता होती है, और मानव ऊतक4 की तुलना में प्रतिरक्षा कोशिका उप-समूह स्थानीयकरण में भिन्न होती है। इसलिए, मानव त्वचा जीव विज्ञान और सूजन के बारे में प्रयोगात्मक निष्कर्ष मानव ऊतक के साथ सत्यापन से लाभ उठाते हैं। जबकि इन विट्रो और ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम मानव ऊतक का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरण हैं, ये सिस्टम अनुपस्थित या अपूर्ण प्रतिरक्षा पुनर्गठन और परिधीय वाहिका5 से संबंध की कमी से सीमित हैं। मानवकृत जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल का उद्देश्य विवो में मानव ऊतकों में प्रतिरक्षा और गैर-प्रतिरक्षा मार्गों के चिकित्सीय या जैविक हेरफेर की अनुमति देना है।
मानव त्वचा जेनोग्राफ्ट मॉडल का उपयोग त्वचा शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी का अध्ययन करने, प्रतिरक्षा अस्वीकृति और प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने, मानव त्वचा कैंसर तंत्र को विच्छेदित करने और त्वचा रोगों और घाव भरने को समझनेके लिए किया गया है। त्वचा अनुसंधान के कई क्षेत्रों पर लागू होने के बावजूद, जेनोग्राफ्ट मॉडल में इन विट्रो अध्ययनों की तुलना में कम थ्रूपुट है और माउस मॉडल में नियोजित आनुवंशिक हेरफेर की आसानी का अभाव है। इस मॉडल के भीतर समय बिंदु हफ्तों से महीनों तक हो सकते हैं, और सफल ग्राफ्टिंग के लिए इन सर्जरी को करने के लिए उचित सुविधाओं और उपकरणों की आवश्यकता होती है। हालांकि, जेनोग्राफ्ट मॉडल प्रयोगों के लिए जैविक और शारीरिक संदर्भ प्रदान करता है, जबकि ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम, जैसे ऊतक खोज, को अक्सर विशिष्ट समय अंतराल पर बहिर्जात संकेतों जैसे गतिशील भागों के असंख्य की प्रतिकृति की आवश्यकता होतीहै। इसलिए, इस मॉडल का उपयोग विट्रो और माउस मॉडल के भीतर देखे गए निष्कर्षों को और अधिक मान्य करने के लिए किया जाता है, या ऐसे काम के लिए जो अन्यथा जैविक रूप से संभव नहीं है। जेनोग्राफ्ट मॉडल का उचित उपयोग विवो में बरकरार मानव ऊतक का अध्ययन और हेरफेर करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करता है।
जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल का अनुकूलन समय के साथ ग्राफ्ट अखंडता को संरक्षित करने के लिए दशकों के शोध पर निर्भर है। इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण गैर-मोटे मधुमेह (एनओडी)-स्सिड इंटरल्यूकिन -2 गामा चेन रिसेप्टर (एनएसजी) माउस का उपयोग कर रहा है, जिसमें बी और टी अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं, कार्यात्मक एनके कोशिकाओं की कमी है, और मैक्रोफेज और डेंड्राइटिककोशिकाओं में कमी है। इन एनएसजी मेजबानों की इम्यूनोडेफिशिएंसी प्रकृति मानव हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं, रोगी-व्युत्पन्न कैंसर और त्वचा 8,9,10 के प्रत्यारोपण की अनुमति देती है। इस इम्यूनोसप्रेसिव मेजबान वातावरण के बावजूद, ग्राफ्ट सफलता10 के लिए एंटी-जीआर 1 प्रशासन द्वारा माउस न्यूट्रोफिलिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अतिरिक्त दमन आवश्यक है। बरकरार ऊतक के प्रत्यारोपण में प्रमुख बाधाएं संक्रमण, अस्वीकृति और ग्राफ्ट में रक्त के प्रवाह को फिर से स्थापित करने में कठिनाई हैं, जिससे कभी-कभी त्वचीय और एपिडर्मल अखंडता का नुकसान होताहै। एंटी-एफआर 1 के प्रशासन और उचित ग्राफ्ट गहराई के उपयोग सहित तकनीकें ग्राफ्ट उत्तरजीविता में सुधारकरती हैं। सावधानीपूर्वक अनुकूलन एनएसजी चूहों पर 90% -100% तक उच्च दक्षता और जीवित रहने की दर के साथ मानव जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण करना संभव बनाता है।
माउस जेनोग्राफ्ट त्वचा प्रत्यारोपण मॉडल विवो सेटिंग14 में मानव त्वचा प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को यंत्रवत रूप से विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। सफल त्वचा जेनोग्राफ्ट प्र?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को TRex Bio से प्रायोजित अनुसंधान समझौतों और एनआईएच (1R01AR075864-01A1) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जेएमएम कैंसर रिसर्च सोसाइटी (अनुदान 26005) द्वारा समर्थित है। हम एनआईएच पी 30 डीके063720, एस 10 1 एस 10 ओडी021822-01, और एस 10 1 एस 10 ओडी018040-01 अनुदान द्वारा समर्थित पार्नासस फ्लो साइटोमेट्री कोर को स्वीकार करते हैं।
10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |