Den nuværende protokol beskriver, hvordan man transplanterer menneskelig hud på ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gammakædereceptor (NSG) mus. Rapporten indeholder en detaljeret beskrivelse af klargøring af menneskers hud til transplantation, klargøring af mus til transplantation, transplantation af menneskelig hud med delt tykkelse og genopretningsprocedure efter transplantation.
Den humane hud xenograft-model, hvor human donorhud transplanteres på en immundefekt musevært, er en vigtig mulighed for translationel forskning inden for hudimmunologi. Murine og menneskelig hud adskiller sig væsentligt i anatomi og immuncellesammensætning. Derfor har traditionelle musemodeller begrænsninger for dermatologisk forskning og lægemiddelopdagelse. Imidlertid er vellykkede xenotransplanter teknisk udfordrende og kræver optimal forberedelse af prøve- og musetransplantatstedet til podning og værtsoverlevelse. Den nuværende protokol giver en optimeret teknik til transplantation af menneskelig hud på mus og diskuterer nødvendige overvejelser for nedstrøms eksperimentelle mål. Denne rapport beskriver den passende forberedelse af en human donor hudprøve, samling af en kirurgisk opsætning, mus og kirurgisk sted forberedelse, hudtransplantation og post-kirurgisk overvågning. Overholdelse af disse metoder muliggør vedligeholdelse af xenotransplantater i over 6 uger efter operationen. Teknikkerne skitseret nedenfor tillader maksimal podningseffektivitet på grund af udviklingen af tekniske kontroller, steril teknik og præ- og postkirurgisk konditionering. Passende ydeevne af xenograftmodellen resulterer i langlivede humane hudtransplantatprøver til eksperimentel karakterisering af human hud og præklinisk testning af forbindelser in vivo.
Musemodeller bruges ofte til at drage slutninger om menneskelig biologi og sygdom, dels på grund af deres eksperimentelle reproducerbarhed og kapacitet til genetisk manipulation. Musefysiologi rekapitulerer imidlertid ikke fuldstændigt menneskelige organsystemer, især hud, og har derfor begrænsninger for anvendelse som præklinisk model i lægemiddeludvikling1. Anatomiske forskelle mellem mus og menneskelig hud omfatter forskelle i epiteltykkelser og arkitektur, mangel på murine ekkrine svedkirtler og variationer i hårcykling2. Desuden er både immunsystemets medfødte og adaptive arme divergerende mellem de to arter3. Musens hud indeholder en unik immunpopulation af dendritiske epidermale T-celler (DETC’er), har en højere overflod af dermale γδ T-celler og varierer i immuncelleundergruppelokalisering sammenlignet med humant væv4. Derfor drager eksperimentelle fund vedrørende human hudbiologi og betændelse fordel af validering med humant væv. Mens in vitro – og organoidkultursystemer er almindeligt anvendte værktøjer til at studere humant væv, er disse systemer begrænset af fraværende eller ufuldstændig immunrekonstitution og manglende forbindelse til perifer vaskulatur5. Den humaniserede xenograft hudtransplantationsmodel sigter mod at muliggøre terapeutisk eller biologisk manipulation af immun- og ikke-immunveje i humant væv in vivo.
Den menneskelige hud xenograft model er blevet brugt til at studere hudfysiologi og farmakologi, analysere immunafvisning og reaktioner, dissekere menneskelige hudkræftmekanismer og forstå hudsygdomme og sårheling6. Selvom den er anvendelig på flere hudforskningsområder, har xenograft-modellen lavere gennemstrømning end in vitro-undersøgelser og mangler den lette genetiske manipulation, der anvendes i musemodeller. Tidspunkter inden for denne model kan variere fra uger til måneder, og vellykket podning kræver passende faciliteter og udstyr til at udføre disse operationer. Xenograft-modellen leverer imidlertid biologisk og fysiologisk kontekst til eksperimenter, mens organoidkultursystemer, såsom vævseksplanter, ofte kræver replikering af et utal af bevægelige dele, såsom eksogene signaler, med bestemte tidsintervaller7. Derfor bruges denne model bedst til yderligere at validere fund observeret in vitro og inden for musemodeller eller til arbejde, der ellers ikke er biologisk muligt. Hensigtsmæssig brug af xenograftmodellen giver en enestående mulighed for at studere og manipulere intakt humant væv in vivo.
Optimering af xenograft hudtransplantationsmodellen har været afhængig af årtiers forskning for at bevare transplantatintegriteten over tid. Kritisk for denne proces er at udnytte den ikke-overvægtige diabetiske (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mus, som mangler B og T adaptive immunceller, funktionelle NK-celler og har mangler i makrofag og dendritiske celler8. Den immundefekte karakter af disse NSG-værter muliggør transplantation af humane hæmatopoietiske celler, patientafledte kræftformer og hud 8,9,10. På trods af dette immunsuppressive værtsmiljø er yderligere undertrykkelse af musens neutrofile immunrespons ved administration af anti-GR1 nødvendig for transplantatsucces10. De største hindringer ved transplantation af intakt væv er infektion, afvisning og vanskeligheder med at genoprette blodgennemstrømningen til transplantatet, hvilket undertiden fører til tab af dermal og epidermal integritet11. Teknikker, herunder administration af anti-FR1 og brug af passende transplantatdybde, forbedrer graftoverlevelsen10. Omhyggelig optimering gør det muligt at udføre human xenograft hudtransplantationer på NSG-mus med høj effektivitet og overlevelsesrater, der spænder fra 90% -100%.
Mus xenograft hudtransplantationsmodellen er en nøgleteknik til mekanisk at dissekere menneskers hudimmunresponser i en in vivo-indstilling 14. Vellykkede hudtransplantationer er afhængige af passende forberedelse af mus og hudprøver og mus og overholdelse af aseptiske gnaveroperationsmetoder15. Hurtig afkøling og korrekt opbevaring af hudprøver ved kolde temperaturer i medier (såsom sterilt saltvand) er vigtigt for at sikre fortsat vævssundhed inden transpl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist finansieret af sponsorerede forskningsaftaler fra TRex Bio og tilskud fra NIH (1R01AR075864-01A1). JMM er støttet af Kræftens Bekæmpelse (bevilling 26005). Vi anerkender Parnassus Flow Cytometry Core delvist støttet af tilskud NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 og S10 1S10OD018040-01.
10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |