该协议提出了用厌氧培养的人阴道细菌阴道定植的小鼠模型。我们专注于 阴道加德纳菌,同时包括 对双普雷沃氏 菌和核 梭杆菌的建议。该方案也可以用作阴道接种和其他厌氧生长细菌的可行回收的指南。
哺乳动物阴道可以被许多细菌类群定植。人类阴道微生物组通常以乳酸杆菌属为主,但四分之一的女性患有细菌性阴道病,其中低水平的乳酸杆菌伴随着各种厌氧细菌的过度生长。这种情况与许多健康并发症有关,包括生殖健康和性健康的风险。虽然越来越多的证据表明微生物相互作用在人类阴道健康中的复杂性,但这些不同厌氧细菌的个体作用尚未完全了解。由于缺乏足够的模型来研究厌氧生长的阴道细菌,情况变得复杂。小鼠模型使我们能够研究这些生物体在体内的生物学和毒力。先前已经描述了阴道细菌接种的其他小鼠模型。在这里,我们描述了接种厌氧生长细菌的方法及其在常规饲养的C57Bl / 6小鼠中的可行恢复。还描述了一种新的,压力较小的阴道接种和清洗程序方法。本文详细概述了加德纳菌的接种和可行恢复,并讨论了其他厌氧菌(如双孢普雷沃氏菌和核梭杆菌)的策略。
在哺乳动物中,阴道是细菌物种联盟的家园。人类阴道微生物组在哺乳动物中是独一无二的,因为它拥有丰富的乳酸杆菌属成员和相应的低阴道pH值(3.8-4.5)1,2,3,4。这种乳酸杆菌优势的破坏与各种负面的健康结果有关。
在细菌性阴道病(BV)中,乳酸杆菌较少,各种厌氧菌(如阴道加德纳菌和普雷沃氏菌5,6)的丰度增加。患有BV的女性发生性传播感染7,8,9,不孕症10,流产11,早产12,13,14,宫内感染15,宫颈感染16和癌症16,17,18的风险增加.BV 还与潜在致病细菌阴道定植的可能性更高有关,例如核梭杆菌1,19,20,一种来自羊水感染的常见分离株 21。
由于厌氧菌在人类阴道健康中的重要性,因此需要可用于研究这些生物的生物学和发病机制的动物模型。在这里,我们描述了雌激素化小鼠阴道加德纳菌阴道接种和可行恢复的方法,并提出了普雷沃氏菌和核梭杆菌的其他策略。以前已经描述了小鼠阴道定植的其他模型,但这些模型侧重于需氧培养的兼性厌氧菌的接种和恢复,例如B组链球菌22和淋病奈瑟菌23。专性厌氧菌的接种和回收可以通过适当的实验策略成功完成。我们讨论了几种细菌分类群的可行恢复方法,并建议对其他感兴趣的物种/菌株的生存条件进行实证评估。
估计活细菌定植的经典方法是菌落形成单位(CFU)的回收。在具有自己的内源性微生物群的传统饲养小鼠中,这需要在琼脂培养基上恢复,琼脂培养基选择内源性阴道微生物群的成员,同时仍然允许接种的细菌菌株生长。在这里,我们使用一种链霉素耐药的阴道 G.24 分离物,该分离物可以在含链霉素的琼脂培养基上选择性地回收。为确保培养基具有足够的选择性,并且相反,内源性微生物组中不存在链霉素耐药细菌,接种前收集的阴道灌洗液应接种在选择性(含链霉素)琼脂上。
接种物制备的最佳方法可能因细菌的种类和菌株而异。在小鼠实验开始之前,应进行初步工作以确定培养基,生长终点和接种物制备的优选条件,以及对氧气的敏感性和PBS中的活力。在对氧更敏感的细菌的情况下,可以考虑接种物的替代制剂(例如,在具有适当载体对照组的厌氧培养基中)25,26。
这里描述的模型与以前发表的阴道接种模型不同的最显着方式是使用厌氧培养的细菌,这需要特别考虑制备活接种物和从小鼠中回收细菌。上述方案中的具体步骤可能略有不同,具体取决于所用细菌的种类/菌株,如 补充文件1所示。此外,这份手稿描述了一种用于管理细菌和阴道冲洗的新程序方法,该方法需要研究者较少的经验,对小鼠的约束较少。如果实验者对步骤3.2中描述的约束形式感到不舒服。和步骤3.3.,可以根据实验设计和机构IACUC指南,在有或没有麻醉的情况下,将小鼠34 改为如前所述。
在小鼠模型中使用厌氧培养细菌的一个重要警告是,某些步骤(例如涉及活体动物的任何步骤)必须在厌氧室外完成。因此,该协议中最关键的步骤是将感兴趣的细菌暴露于有氧环境中的步骤,例如在接种小鼠期间。在该模型中使用任何新的厌氧菌都需要初步调查其在暴露于氧气时保持活力的能力(例如比较接种前和接种后的CFU,如步骤2.5和步骤3.4中所述)。根据生物体的氧气程度和PBS敏感性,应考虑不同的接种物制备方法(补充文件1,步骤2.4.5)。对于使用 阴道G. G. vaginalis JCP8151B的接种,我们发现可以在PBS中制备单管接种物并用于感染所有小鼠。如果使用对氧气更敏感的不同厌氧细菌,则可以在每只小鼠的单独管中制备接种物,这样就不需要重复打开/关闭管子。同样,如果感兴趣的细菌种类比 阴道G. 更苛刻/更不能在PBS中存活,则可以在培养基中制备接种。如果使用的培养基含有还原剂,例如用于培养 普雷沃氏菌 的CDC厌氧菌培养基(补充文件1,步骤2.1.和步骤2.2.),则细菌也将具有增强的氧气暴露保护。
还可以考虑用于均质化的替代方法,例如珠打22,35,这是在管盖关闭的情况下完成的,因此可以引入比手持式均质机更少的氧气。此外,对氧更敏感的生物可能需要更长的培养基平衡时间。氧指示剂如刃天青可用于检查是否已达到厌氧条件(步骤2.1)。厌氧罐等替代方法可能会影响结果,应在使用前检查细菌活力。
实验生物体的氧敏感性和挑剔性也可能在灌洗/均质化期间从小鼠成功回收活细菌中发挥作用(补充文件1,步骤3.2.和步骤5.1.)。对于高度敏感的微生物,灌洗和铺板之间的时间可能导致活力丧失,并导致人为地降低细菌阴道定植率。为了减轻这种影响,收集的灌洗液可以立即稀释到新鲜的厌氧培养基(用还原剂)中。同样,器官匀浆可以在新鲜培养基而不是PBS中进行,以增加细菌活力,也可以在厌氧室本身中进行,以尽量减少氧气暴露。
根据给定实验的目的,实验者必须注意对照组。为了测试假设,仅用载体模拟治疗的未感染对照小鼠的基线测量将有助于确定是否存在趋化因子/细胞因子的诱导或其他感染的特定结果。使用的对照载体必须与用于接种的载体相同,因此如果将细菌接种在培养基中,则必须使用未接种的培养基作为对照(补充文件1,步骤2.4.5)。
该协议中描述的方法也可以应用于能够厌氧生长的兼性细菌,但传统上使用需氧培养条件(例如 大肠杆菌 或B组 链球菌)进行研究。这可能与这些生物体在被认为含有低水平氧气的身体部位(如子宫颈)的感染尤其相关。与有氧接种相比,当厌氧制备接种物时,兼性微生物可能更成功地感染氧气较少的部位。在这样的实验中,回收用于CFU计数的活细菌可能不需要厌氧条件。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Lynne Foster在这些模型开发过程中提供的技术援助。我们感谢分子微生物学系和妇女传染病研究中心(AL)的启动资金,以及March of Dimes(Basil O’Connor奖授予AL),这有助于支持早期实验。美国国家过敏和传染病研究所(R01 AI114635)也支持这些模型的开发。
β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |