Summary

Demonstrando a inervação da pele cabeluda e glabrous em um padrão 3D usando múltiplas abordagens de coloração fluorescente e limpeza de tecidos

Published: May 20, 2022
doi:

Summary

A espessura das seções teciduais limitou o estudo morfológico da inervação da pele. O presente protocolo descreve uma técnica única de limpeza tecidual para visualizar fibras nervosas cutâneas em seções de tecido espessas de 300 μm sob microscopia confocal.

Abstract

A inervação da pele é uma parte importante do sistema nervoso periférico. Embora o estudo das fibras nervosas cutâneas tenha progredido rapidamente, a maior parte da compreensão de suas características distribucionais e químicas vem da coloração histoquímica e imunohistoquímica convencional em seções de tecidos finos. Com o desenvolvimento da técnica de limpeza tecidual, tornou-se possível ver as fibras nervosas cutâneas em seções de tecido mais grossas. O presente protocolo descreve múltiplas manchas fluorescentes em seções de tecido a uma espessura de 300 μm da pele plantar e dorsal do pé traseiro de rato, os dois típicos locais de pele peludo e glabrous. Aqui, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina rotula as fibras nervosas sensoriais, enquanto a falo e o receptor endotelial do vaso endotelial 1 rotulam o sangue e os vasos linfáticos, respectivamente. Sob um microscópio confocal, as fibras nervosas sensoriais rotuladas foram seguidas completamente a uma distância mais longa, correndo em feixes na camada cutânea profunda e estilo livre na camada superficial. Essas fibras nervosas corriam paralelamente ou cercavam os vasos sanguíneos, e os vasos linfáticos formavam uma rede tridimensional (3D) na pele pelirpelenta e glabrous. O protocolo atual fornece uma abordagem mais eficaz para estudar a inervação da pele do que os métodos convencionais existentes do ponto de vista da metodologia.

Introduction

A pele, o maior órgão do corpo, servindo como uma interface chave para o ambiente, é densamente inervada por muitas fibras nervosas 1,2,3. Embora a inervação da pele tenha sido amplamente estudada anteriormente com vários métodos histológicos, como a coloração em seções de pele e tecido demontagem total 4,5,6, a demonstração detalhada e eficaz de fibras nervosas cutâneas ainda é um desafio 7,8. Diante disso, o presente protocolo desenvolveu uma técnica única para exibir fibras nervosas cutâneas mais claramente na seção de tecido grosso.

Devido ao limite pela espessura das seções, a observação de fibras nervosas da pele inervadas não é precisa o suficiente para descrever com precisão a relação entre as fibras nervosas relacionadas ao gene da calcitonina (CGRP) e tecidos e órgãos locais a partir das informações de imagem adquiridas. O surgimento da tecnologia de limpeza de tecidos 3D fornece um método viável para resolver esse problema 9,10. O rápido desenvolvimento de abordagens de limpeza de tecidos tem oferecido muitas ferramentas para estudar estruturas teciduais, órgãos inteiros, projeções neuronais e animais inteiros nos últimostempos 11. O tecido da pele transparente pode ser imageado em uma seção muito mais espessa por microscopia confocal para obter os dados para visualizar fibras nervosas cutâneas.

No presente estudo, a pele plantar e dorsal de um pé traseiro de rato foi selecionada como os dois locais alvo de pelepelrosa e glabrous 3,4,7. Para traçar as fibras nervosas cutâneas a uma distância maior, o tecido da pele foi cortado na espessura de 300 μm para coloração imunohistoquímica e histoquímica, seguido de tratamento de limpeza tecidual. O CGRP foi usado para rotular as fibras sensoriais do nervo12,13. Além disso, para destacar as fibras nervosas cutâneas no fundo tecidual, a faloidina e o receptor de hialuronan do vaso linfático 1 (LYVE1) foram ainda utilizados para rotular os vasos sanguíneos e os vasos linfáticos, respectivamente14,15.

Essas abordagens forneceram um método simples que pode ser aplicado para demonstrar uma visão de alta resolução das fibras nervosas cutâneas e também para visualizar a correlação espacial entre as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos na pele, o que pode fornecer muito mais informações para entender a homeostase da pele normal e a alteração cutânea sob as condições patológicas.

Protocol

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-04-13-1). Todos os procedimentos foram realizados seguindo o Guia Nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Neste estudo foram utilizados três ratos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Todos os animais foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12h com temperatura e umidade controladas …

Representative Results

Após a coloração fluorescente tripla, as fibras nervosas, vasos sanguíneos e vasos linfáticos foram claramente rotulados com CGRP, phalloidin e LYVE1, respectivamente, na pele pelrosa e glabrou (Figura 3,4). Com o tratamento de compensação, as fibras nervosas CGRP positivas, os vasos sanguíneos fábula positivo e os vasos linfáticos LYVE1 positivos podem ser imagens em maior profundidade para adquirir as informações estruturais completas da pele (<strong class="xf…

Discussion

O presente estudo fornece uma demonstração detalhada das fibras nervosas cutâneas na pele pelrosa e glabrous usando imunofluorescência em seções de tecido mais grosso com tratamento de limpeza e uma visão 3D para entender melhor a inervação da pele. O tempo de incubação de anticorpos de até 1-2 dias e um processo de limpeza noturno são importantes. Estas duas etapas-chave afetam diretamente o efeito de coloração da imunofluorescência de seções grossas. Outro problema foi levantado a partir da escolha de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelo China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (Project Code no. CI2021A03404) e o Fundo Nacional de Inovação Interdisciplinar da Medicina Tradicional Chinesa (Project Code no. ZYYCXTD-D-202202).

Materials

1x phosphate-buffered saline Solarbio Life Sciences P1020 pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol Sigma Life Science T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy Olympus Corporation Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 Abcam plc. ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 Abcam plc. ab175676
EP tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001 1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system Leica Biosystems CM1860
Imaris Software Oxford Instruments v.9.0.1
IRIS standard scissor WPI (World Precision Instruments Inc.) 503242
iSpacer SunJin Lab co. IS005
Micro forceps-Str RWD F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody Santa cruz biotechnology, Inc. sc-57053
Neutral buffered Formalin Solarbio Life Sciences G2161 10%
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 mL
Peristaltic pump Longer Precision Pump Co., Ltd BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A12381
RapiClear 1.52 solution SunJin Lab co. RC152001 10 mL
Regular agarose Gene Company Limited G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str RWD F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody R&D Systems, Inc. AF7939
Six-well plate Corning Incorporated 3335
Sodium azide Sigma Life Science S2002 25 g
Sucrose Sigma Life Science V900116 500 g
Super Glue Henkel AG & Co. Pattex 502
Surgical Handles RWD S32003-12
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 mL
Urethane Sigma Life Science U2500 500 g
VANNAS spring scissors RWD S1014-12
Vibratory microtome Leica Biosystems VT1200S

References

  1. Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
  2. Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
  3. Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
  4. Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
  5. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
  6. Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
  7. Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
  9. Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
  10. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  11. Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
  12. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  13. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
  14. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
  15. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
  16. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  17. Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
  18. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  19. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  20. Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
  23. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
  24. Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
  25. Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).

Play Video

Cite This Article
Wang, X., Cao, W., Shi, J., Zhang, X., Qu, Z., Xu, D., Wan, H., Su, Y., He, W., Jing, X., Bai, W. Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches. J. Vis. Exp. (183), e63807, doi:10.3791/63807 (2022).

View Video