Isolamento, cultura e caracterização de células primárias de schwann, queratinócitos e fibroblastos de Foreskin Humano
Summary
O estudo da cicatrização de feridas associadas à lesão musculoesquelético muitas vezes requer a avaliação de interações in vitro entre células schwann (SCs), queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo descreve o isolamento, acultura e a caracterização dessas células primárias do prepúcio humano.
Abstract
Este protocolo descreve métodos de isolamento, condições de cultivo e caracterização de células primárias humanas com alto rendimento e viabilidade usando rápida dissociação enzimática da pele. Queratinócitos primários, fibroblastos e células Schwann são todos colhidos do prepúcio de recém-nascido humano, que está disponível seguindo o padrão de procedimentos de cuidado. A pele removida é desinfetada, e a gordura subcutânea e músculo são removidos usando um bisturi. O método consiste na separação enzimática e mecânica de camadas epidérmicas e dérmicas, seguida de digestão enzimática adicional para obter suspensões unicelulares de cada uma dessas camadas de pele. Finalmente, as células únicas são cultivadas em meios de cultura celular apropriados seguindo protocolos padrão de cultura celular para manter o crescimento e a viabilidade ao longo de semanas. Em conjunto, este protocolo simples permite o isolamento, acultura e a caracterização dos três tipos de células a partir de um único pedaço de pele para avaliação in vitro de modelos de nervo da pele. Além disso, essas células podem ser usadas juntas em co-culturas para medir seus efeitos uns sobre os outros e suas respostas ao trauma in vitro na forma de arranhões realizados roboticamente na cultura associada à cicatrização de feridas.
Introduction
As células primárias derivadas do tecido vivo e cultivadas sob condições in vitro se assemelham muito ao estado fisiológico1, tornando-as um modelo ideal para investigar processos fisiológicos e fisiofósicos. A pele contém vários tipos de células, incluindo queratinócitos, fibroblastos, sebocítos, melanócitos e células schwann (SCs), que podem ser isoladas e cultivadas para experimentos in vitro . Não foram descritos métodos para isolar e cultivar queratinócitos, fibroblastos e SCs, de um único pedaço de pele. O objetivo deste protocolo é duplo: 1) estabelecer um método confiável e reprodutível para o isolamento e cultivo de SCs dérmicas e 2) para utilizar um método eficiente e robusto para o isolamento de queratinócitos, fibroblastos e SCs de um único prepúcio humano.
Atualmente, existem protocolos estabelecidos para isolar os queratinócitosda pele 2,3,4 e os fibroblastos 5,6. Esses estudos descrevem o isolamento de queratinócitos, fibroblastos ou ambos da pele, mas nenhum protocolo aborda como estabelecer culturas de SCs primários da pele humana. Estudos recentes sugerem que as SCs neuronais modulam os processos celulares querat e fibroblasto e regulam as funções fisiológicas normais da pele7. As SCs são, portanto, críticas à homeostase da pele e contribuem substancialmente para a fisiologia regular que influencia o comportamento dos tipos de células da pele vizinhas presentes8. Portanto, um protocolo que permite o isolamento de cada um desses tipos de células é ideal para experimentos in vitro envolvendo comunicação celular-célula ou conversa cruzada entre tipos de células.
Este protocolo descreve o estabelecimento de culturas celulares individuais de células primárias a partir de um único pedaço de pele. Este protocolo é particularmente útil quando a quantidade de tecido disponível é limitada. Além disso, o isolamento de todos os três tipos de células de um único doador permite comparações robustas entre tipos de células ou experimentos de co-cultura, ao mesmo tempo em que mitiga a influência da genética durante o experimento desejado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para isolar três populações de células distintas de um único pedaço do prepúcio, ou seja, queratinócitos, fibroblastos e células Schwann. Existem alguns protocolos de isolamento disponíveis para isolar queratinócitos e fibroblastos 2,3,5,6, mas nenhum descreve o isolamento de SC. Além das principais células estruturais da pele, queratinócitos e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Fadia Kamal e ao Dr. Reyad Elbarbary por nos permitir usar instrumentos de laboratório e suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por subvenções do NIH (K08 AR060164-01A) e do DOD (W81XWH-16-1-0725) a J. C. E. além do apoio institucional do Centro Médico Hershey da Universidade Estadual da Pensilvânia.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
References
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