本方案详细介绍了果 蝇 蛹固定组织的制备和可视化。它可用于完整或受伤的组织,并保留组织的原始结构。解剖、固定和染色的步骤在本文中均有介绍。
果蝇黑腹蛹在过程中几天不动,在此期间它们发展出具有薄透明成虫外皮的新身体。它们的不动性和透明度使其成为体内实时成像实验的理想选择。许多研究都集中在蛹的背上皮单层上,因为它的可接近性和相对较大的尺寸。除了研究上皮力学和发育外,骨骼一直是研究伤口愈合的理想组织。受伤后,整个上皮修复过程可以通过6-12小时的实时成像来捕获。尽管notum在实时成像中很受欢迎,但很少有已发表的研究使用固定的notum样本。固定和染色是几乎所有其他果蝇组织的常用方法,利用了简单细胞染色和抗体的大量库。然而,蛹是脆弱的,从体内取出后容易卷曲和变形,因此很难补充现场成像。该协议为固定和染色蛹提供了一种简单的方法,无论是完整的还是在激光损伤后。使用这种技术,将蛹的腹侧粘在盖玻片上以固定蛹,并且仔细地去除,固定和染色公瘤。上皮套安装在载玻片上或两个盖玻片之间,以方便从组织的背侧或腹侧进行成像。
在过去的十年中, 黑腹果蝇 的蛹越来越多地用于实时成像研究,因为该动物既不动又具有透明的角质层,在此阶段具有透明的角质层1,2,3,4,5,6,7。然而,蛹的解剖和固定具有挑战性,因此很难用抗体和细胞染色来补充活体成像研究。这项工作的总体目标是创建一种可重复的方案,用于解剖和固定蛹,以便在新的或先前的活体成像样品上进行抗体和细胞染色。
当幼虫开始时,表皮从幼虫角质层中拉出,形成坚硬的蛹病例8。分解幼虫身体计划,并制定新的成年身体计划。在此期间,蛹是不动的,使其成为实时成像的理想选择。一种常见的成像组织是蛹,一种在背胸部形成的成体单层上皮。经过简单的解剖以去除蛹病例9后,可以在视觉上访问notum。然后可以安装整个动物,并且可以对notum进行数小时或数天的实时成像,使其成为研究发育,体内平衡和受伤后上皮细胞行为的理想组织10,11,12,13,14。然而,切屑和修复是具有挑战性的,因为它是脆弱的,并且覆盖着疏水的薄透明的成人角质层。这种疏水性角质层使其在从身体其他部位移除时容易在水溶液中卷曲。因此,Notum解剖和固定的报道很少,并且解剖通常没有描述15,16,17,18。如果文献中没有详细的方案, 果蝇 研究人员很难用蛹染色来补充活体成像。
该技术旨在可重复地解剖和修复先前已实时成像的样本,包括那些被激光打伤的样本。由于活体成像需要切除蛹病例,因此这种解剖技术首先切除蛹前病例,这与以前在蛹病例4,19,20内固定或一分为二的方案不同。骨是一种脆弱的组织,受伤可能会加剧其脆弱性。因此,为了支持这种脆弱的组织,将鼻孔的外皮(上皮和附着的透明成人角质层)以及头部和腹部的一部分从蛹的其余部分解剖出来,同时始终浸没在水环境中。这种方法降低了组织卷曲和不可用的可能性。该技术早在受伤后30分钟(图1E-H)和受伤后3小时(图1I-L)就成功地染色了受伤的Notum组织。该方案有望在结核发育或伤口修复期间有效。目前的技术将有助于希望将蛹的实时成像能力与大量可用的免疫组化试剂相结合的研究人员。
关键步骤
优化三个步骤将大大提高该协议的成功率。首先,在步骤1.5中,将胶水涂在盖玻片上。如果加入过多的胶水,蛹会被一层厚厚的凝固胶水所缠绕,使解剖变得不可能,如果它覆盖在结膜本身,胶水会遮挡样品中的光线。其次,在步骤2.3-2.6中,确保仅移除顶端的顶部圆顶,排除尽可能多的侧组织。如果包括,侧组织在安装过程中会被压缩,并导致公网的中间向内弯曲,通常将其放置在高数值孔径物镜的工作距离之外。第三,在清洁步骤2.9期间,必须格外小心,不要损坏单层上皮。如果组织有很大一部分缺失或无法检测到信号,则此步骤可能是罪魁祸首。
故障 排除
问题1:安装后,蛹在解剖过程中从双面胶带中脱落。这是一个常见问题,特别是对于初学者。最好的补救措施是确保蛹壳的外部完全干燥/没有食物残渣。用一对钝镊子去除食物,让盒子风干10-15分钟将有助于粘附在胶带上。或者,在解剖过程中,使用非惯用手和一对钝镊子将蛹压在胶带上。如果问题仍然存在,在外壳后端的底部涂抹一小滴5-10μL指甲油并使其变硬通常为最不严谨的蛹提供足够的粘附力。
问题 2:Notum 在步骤 2.3 中崩溃,或者通过外表的初始突破不顺利。如果外皮难以破坏,则固定步骤中可能粘附胶过多。将解剖的蛹放入较少的粘性胶水中将改善此问题。此外,确保显微切割剪刀锋利。钝剪刀将无法切入外皮,并倾向于使其向内塌陷。一旦血淋巴从蛹中溢出,请确保其中一个切割刀片可以进入蛹而不会导致蛹变形。如果蛹塌陷并且刀片没有进入蛹,请继续剪裁,直到刀片进入蛹。
问题 3:在步骤 2.4 中,剪刀会夹住或拖动外皮。如果剪刀开始抓住或拖曳外皮,通常有助于切换到蛹的另一侧并继续“松开”外皮。进一步钝化显微切割剪刀会使外皮难以实现干净切割,必须使用削尖的剪刀。
问题4:样品在染色过程中被意外吸出(步骤3.1-3.6)。解剖的notum很难看到,因为它是透明的。在盖玻片下方放置深蓝色或黑色的纸张以提供对比度可能会有所帮助(旧的移液器吸头架架架效果很好。此外,所有溶液更换都可以在解剖显微镜下进行。
问题 5:未检测到信号/检测到零星信号。在排除了污渍特异性问题后,如果未检测到信号或信号不完整,则步骤2.9(清洁)可能是罪魁祸首。缺失或斑片状信号可能源于清洁过程中上皮组织的损伤和去除。相反,如果不去除肌肉带/脂肪体细胞,信号差可能是由肌肉带/脂肪体细胞的闭塞引起的,因为它们可以限制污渍和抗体相对于周围组织扩散到公孔中。如果组织受损,在清洁过程中更温和是最好的解决方案。相反,如果污渍是可见的但斑块状的,建议增加专门用于清洁步骤的活力/时间,以尽可能多地去除肌肉和脂肪。此外,增加污渍持续时间可以通过更好的清洁来帮助解决这个问题。
问题6:在成像过程中,骨组织具有翘曲/皱纹的外观。组织的翘曲和皱纹来自两个来源。首先,在安装过程中压缩公仔会导致其弯曲和翘曲。最好的解决方案是尽可能多地去除侧组织,使圆顶尽可能短,并且可以安装在盖玻片垫片之间。其次,如果在解剖过程中将套管弯曲,则在安装过程中不会拉直该弯曲,因此在解剖过程中必须格外小心,以免翘曲鼻孔。当将外皮从蛹的其余部分切开时,耳蜗的意外弯曲是最常见的。将解剖剪刀与蛹成一定角度,而不是将它们作为蛹保持在样品平面中是很诱人的。然而,倾斜的剪刀会导致外皮在切割时向上弯曲,而不是保持平坦。
现有方法、限制和未来应用
Wang等人20 报道了一种类似的解剖方案,用于分离蛹上皮。这种技术要求蛹留在其外壳内,并用手术刀迅速一分为二。该协议与先前的实时成像样品不兼容,因为实时成像需要去除蛹壳的很大一部分。由于蛹缺乏强直性,病例外的蛹二分切术破坏了组织,激发了该协议的创建。这里详细介绍的技术允许分离和固定notum,并且可以用作各种其他方法的第一步,例如冷冻切片, 原位 杂交或电子显微镜。
此技术有一些限制。首先,解剖,固定和染色notum比在notum中活成像荧光标记的蛋白质更耗时,这只需要简单的解剖即可去除蛹壳9,23。其次,与其他果蝇组织的解剖相比,由于组织薄而脆弱和疏水性角质层,这种解剖更加困难。对于上果 蝇 中的蛋白质的简单可视化,固定胚胎,幼虫翼盘或卵巢的免疫组化更容易。然而,这种技术允许实时成像的强大功能与固定和染色相结合,使其成为一旦掌握的强大工具。
与现场成像相比,解剖/固定技术具有一些优势。基底(内部)结构可以用基底视图更好地解析(图5L,J)。最重要的是,活体成像仅限于必须通过基因提供的荧光团,通常需要冗长的遗传杂交方案。相反,本方案允许应用染色剂,免疫组织化学和其他需要解剖和固定的技术。这大大增加了在组织中探测的信号数量,同时可能缩短了获得实验结果的时间。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢M. Shane Hutson博士建立用于蛹损伤的激光消融系统,以及他对开发方案的贡献和反馈。这项工作得到了1R01GM130130对APM和M. Shane Hutson的支持。JW 由 2T32HD007502-21 提供支持。
½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
NIS Elements Software | Nikon | AR | |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |