ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

Drosophila melanogaster (זבובי פירות) נשמרו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על מדיום סטנדרטי של קמח תירס-מולסה. המחקרים נערכו על גולמי היסטון H2A המתויגים על ידי EGFP (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). הזבובים התקבלו ממרכז מניות ציבורי (ראו טבלת חומרים). 1. שיתוק גלמים יש למרוח רצועה בגודל 2 אינץ’ של סרט הדבקה דו-צדדי על שקופית מיקרוסקופ. זהה פרה-פופים לבנים בבקבוקונים המוגבהים ב-25 מעלות צלזיוס, והשתמש בסמן כדי לציין את מיקומם מחוץ לבקבוקון. החזירו את הבקבוקונים ל-25 מעלות צלזיוס.הערה: פרה-פופים לבנים מאופיינים בחוסר התנועה שלהם, בצבע הלבן ובספירקלים האוורקטיים שלהם. אלה יוצרים 0-1 שעות לאחר היווצרות puparium (APF), או שלב P18. 12-15 שעות לאחר מכן, הסר בזהירות 3-4 מהגלמים המצוינים (מבלי להקפיץ אותם) באמצעות היקף דיסקציה ואסוף אותם על שקופית המיקרוסקופ שליד הקלטת.הערה: הגלמים יהיו כעת שלב P5 עם שק ראש מחודד הנראה בקצה הקדמי של הגלם8. מניחים את הגלמים במרחק של לפחות רוחב גולם אחד זה מזה על הקלטת כשצדי הגחון שלהם למטה. הניחו טיפה של דבק דבק על סרט פרפין (ראו טבלת חומרים) או במכסה צינור צנטריפוגה. טובלים את הקצה של קצה פיפטה של 0.1-10 μL (ללא פיפטה) בטיפה של דבק דבק. הקישו פעמיים על קצה הפיפטה על מכסה בגודל 24 מ”מ על 60 מ”מ (עובי 1.5), במרחק של 1 ס”מ על 1 ס”מ מהפינה, ויצרו קו של דבק דבק באורך של כ-1/2 מאורך הגלם. הגדירו מראש פיפטה של 0.2-2 מיקרול(P2) ל-2 מיקרול’ל, ופיפטה של 200 מיקרול’ (P200) ל-200 מיקרול’, והתאימו להם קצוות כך שיהיו מוכנים למילוי ב-1x PBS + 0.1 mM Ca2+, שימצקו במהירות את הדבק הדבק במגע. הכנס מלקחיים (ראה טבלת חומרים) ליד צד הראש והסר בעדינות את המארז מהחלק הקדמיל-9 האחורי. הסר כמה שיותר מהמקרה. תפסו את רגליו המתפתחות של הגלם עם זוג מלקחיים קהים ומשכו בזהירות את הגלם מהנרתיק שלו.הערה: קרע קטן בחלק הגחוני של הגלמים לא יזיק להליך זה. הניחו את הגלמים בפינת הכיסוי. תפסו את הגלם בבטן האחורית או בכנף המתפתחת עם מלקחיים קהים, הרימו והניחו את הצד הגחוני של הגלם כלפי מטה לתוך קו הדבקה. מלא במהירות את הפיפטה P2 עם 2 μL של 1x PBS + 0.1 mM של Ca2+, והחזקתו באוויר, גרש מספיק כדי ליצור בועה קטנה בקצה (0.25-0.5 μL). גע בבועה הקטנה של התמיסה לצד אחד של הגלמים בבסיס בית החזה, ואז חזור על הפעולה בצד השני.הערה: פעולה זו תמצק כמות קטנה של דבק הדבק כדי להחזיק את הגלם במקומו. בדרך כלל, לא ייעשה שימוש בכל הפתרונות. מלאו את הפיפטה P200 ב-200 μL של 1x PBS + 0.1 mM של Ca2+, ואז הניחו את קצה הפיפטה על בית החזה והוציאו את התוכן כדי להטביע את הגלמים לחלוטין. שארית הדבק יתמצק מיד. הסר כ-100 μL של תמיסת PBS, כך שהגלמים בקושי שקועים לפני שהם ממשיכים מיד לשלב הבא.הערה: עבור דוגמאות שלא שולמו, התחל משלב 1.1. עבור דגימות פצועים שנותחו חלקית, התחל בשלב 1.5. פציעה באמצעות אבלציה בלייזר תוארה בעבר14,21. יש לבצע את שלבי האימוביליזציה, הנתיחה וההרכבה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה. 2. ניתוח הנום תפסו זוג מספריים של מיקרו-דיסקציה שמצמידים צד אחד של הידית לאצבע המורה ולאצבע האמצעית של היד הדומיננטית, כך שהאגודל של היד הדומיננטית מפעיל את כוח החיתוך (איור 2A,B). ייצבו את צוואר המספריים כנגד האצבע האמצעית של היד הלא דומיננטית תוך כדי ליטוף הכיסוי עם אצבע הטבעת של היד הלא דומיננטית. חותכים באמצע הבטן הגבית כדי ליצור חור קטן, ~0.2-0.5 מ”מ. חלק מההמולימף בדרך כלל יישפך החוצה והוא אינדיקציה טובה להפרה. בצע חתכים קטנים של 0.5-0.75 מ”מ דרך הכסות האחורית לקדמית, תוך כיתור הרקמה הגבית כדי לבודד אותה. כדי ליצור רקמה שטוחה ככל האפשר, הימנע חיתוך גחוני מדי; יש להסיר רק את ‘הכיפה’ הגבית של בית החזה יחד עם חלקים קטנים של הראש והבטן. חזרו על חתכים אחוריים קדמיים בצד השני של הגלמים. סובבו את שלב הנתיחה כדי לאפשר חיתוך נקי בראש במידת הצורך.הערה: בשלב זה, הכסות הגבית, או נוטום, תופרד משאר הגלמים. אם הוא נראה מופרד אך לא מועבר בקלות, כמה חתכים מתחת לנוטום יכולים לעזור להיפטר ממנו. הוסיפו כ-200 μL של 1x PBS למרכז הכיסוי וצרו תעלה המחברת אותה לטיפת הנתיחה המקורית על ידי גרירה עדינה של קצה הפיפטה על פני זכוכית הכיסוי מהטיפה החדשה אל המקור. באמצעות זוג מלקחיים קהים, דוחפים או גוררים בעדינות את הנוטום המבודד למרכז הכיסוי ומסובבים, כך שהצד הפנימי פונה כלפי מעלה. לעולם אל תסיר את הרקמה מהטיפה.הערה: חיוני להרחיק את הנוטום מאתר הנתיחה המקורי כדי למנוע שרידים של דבק הדבק שחוסם את הדגימה במהלך הדמיה מאוחרת יותר. החזיקו את הנוטום עם המלקחיים הבוטים על ידי לחיצה לתוך חלקי הבטן או הראש. באמצעות זוג מלקחיים חדים ו/או גירושים עדינים של 1x PBS מפיפטה של 200 μL, הסר את כל שאריות השומן בגוף, רצועות השרירים או ההמולימפה (אם קיימות) כדי לחשוף באופן מלא את האפיתל החד-שכבתי יותר ולהפוך את הכתם הסופי לאחיד יותר. הנוטום המנותח אמור להופיע כמו באיור 3A. לאחר שהרקמה נקייה, השתמש בפיפטה של 200 μL כדי להסיר כמה שיותר מתמיסת ה- PBS (יחד עם פסולת ואת החלק הגחוני של הגלם), ניטור עם היקף דיסקציה כדי למנוע שאיפה לנוטום. לאחר שרוב הנוזלים הוסרו, השתמשו ברקמה סופגת כדי לנגב בזהירות את שאר הדבק והגרם, כמו גם כל פסולת אחרת שנשארת על הכיסוי.הערה: אם נשאר דבק דביק כלשהו על הכיסוי, הוא לא יגרום לבעיה כל עוד הוא דק יותר מהרקמה הגבית עצמה. הוסף 150-200 μL של 4% PFA (ב 1x PBS) ותקן במשך 20 דקות בטמפ ‘ החדר. בהתאם למהירות הנתיחה, ניתן לנתח גולם אחד או יותר במהלך הקיבעון של הגלם הראשון. הסר את ה- PFA והחלף אותו ב- 1x PBS כדי לשטוף את ה- notum פעם אחת במשך 30 שניות. אם ממשיכים עם צביעת נוגדנים, בצע שטיפות של 5 דקות (3 פעמים) ב- 1x PBS או 1x PBST (קובץ משלים 1) כדי לחלחל לרקמה אם האנטיגן הוא תוך תאי. אחסן את הדגימה ב- 1x PBS + 0.02% NaN3 למשך הלילה בתא לח, או אם אתה מתכנן להכתים את הרקמה, דגירה למשך הלילה בתמיסת חסימה (קובץ משלים 1). 3. צביעת הנוטום הערה: לצביעה באמצעות נוגדנים או כתמים תאיים בצע את השלבים הבאים. -אין להסיר את הנוטום מהתמיסה, שכן סביר להניח שהדבר יגרום לרקמה להתכרבל. לפיכך, התאימו את פרוטוקולי הכתם כך שיתנהלו במלואם על הכיסוי ושמרו בתא לח למשך כל שלב ארוך יותר מ-5 דקות. ניטור הדגימות תחת מיקרוסקופ דיסקציה יכול לסייע במניעת שאיפה מקרית של הרקמה במהלך שטיפות. כדי לדמיין את גבולות התא, דגירה ב-200 μL של נוגדן IgG2a ראשוני נגד FasIII של העכבר (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 1:8 מדולל במאגר חסימה + 0.02% NaN3 לילה ב-4 °C (4 °C). שטפו את עודפי הנוגדן הראשוני (3 פעמים) עם 200 μL של 1x PBS + 0.02% NaN3 למשך שעה אחת לכל כביסה בטמפרטורת החדר. בצע דגירה משנית של נוגדנים עם 200 μL של ריכוז 1:200 נגד עכבר IgGa2 ב- Cy3 ב- Blocking Buffer + 0.02% NaN3 למשך 2 שעות בטמפ ‘ החדר. שטפו את עודפי הנוגדן המשני (3 פעמים) עם 200 μL של 1x PBS + 0.02% NaN3 למשך שעה אחת לכל כביסה בטמפרטורת החדר. כדי לדמיין את הגרעינים, דגירו דגימות ב-1 מיקרוגרם/מ”ל של DAPI למשך 45 דקות כדי לאפשר מספיק זמן לכתם לחדור דרך רצועות השרירים; תיקון במדיום הרכבה המכיל DAPI אינו יעיל עם רקמה זו. יש לשטוף את עודפי ה-DAPI (3 פעמים) עם 200 μL של 1x PBS + 0.02% NaN3 למשך 5 דקות לכל כביסה בטמפרטורת החדר, ואז להשאיר ב-200 μL של 1x PBS + 0.02% NaN3 למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, או להרכיב מיד. 4. הרכבה והדמיה של הנוטום לאחר ההכתמה, הכינו 24 × 60 כיסויים (טופר) חדשים עם תמיכות.הערה: מכיוון שהנוטום הוא בצורת כיפה, שיטוחו לחלוטין גורם לרקמה מקומטת מעוותת. יצירת רווח בין שני הכיסויים מאפשרת לנוטום לשמור על צורתו הרגילה. צרו מרווח של כ-200 מיקרומטר על ידי שימוש במרווחים העשויים מ-22 x 22 כיסויים (עובי מס’ 0, בעובי של כ-100 מיקרומטר), המודבקים כ-1 ס”מ זה מזה עם לק באמצע הטופר. כדי להיצמד, מניחים את המרווחים על הטופר וצובעים את הקצוות הדיסטליים של המרווחים בשכבה דקה של לק. תנו לייבוש.הערה: השתמש רק בלק לציפורניים דק ומנוזל; לק עבה יוסיף רווח נוסף מיותר בין הכיסויים והטופר. הסר כמה שיותר מהתמיסה מימית מהמדגם. יש למרוח מיד שתי טיפות (כ-100 μL) של מדיום הרכבה נגד דהייה (ראו טבלת חומרים) על הדגימה. במידת הצורך, השתמש במלקחיים נקיים וחדים כדי למקם את הנוטום במרכז הטיפה הבינונית המורכבת נגד דהייה. הניחו את הכיסוי עם ה-notum על תמיכה של כ-10×40 מ”מ, כגון חתיכת קצף דקה (שנחתכה מחומר האריזה בתוך קופסאות כיסוי), כדי להעלות את הדגימה כך שהיא לא תיצמד למשטח העבודה. תחת טווח דיסקציה, הורידו באיטיות את הטופר אל המדגם. ברגע שמדיום ההרכבה נגד דהייה פוגש את הטופר, שחררו בעדינות ואפשרו לפעולה נימית למשוך את החלק העליון למטה.הערה: במהלך השניות הראשונות, ניתן לבצע התאמות קלות למצב הכיסוי מבלי לפגוע בנוטום. הניחו פיסת קצף נוספת על הטופר והשתמשו במגלשת מיקרוסקופ סטנדרטית כמשקל כדי לשדל בעדינות את מדיום ההרכבה נגד דהייה בין כיסוי הדגימה, הטופר והמרווחים. לאחר 5-10 דקות, השתמשו ברקמה סופגת כדי לנתק כל עודף של מדיום הרכבה נגד דהייה על ידי נגיעה עדינה בשולי הכיסוי. יש למרוח בעדינות את הלק על כל פינה של הכיסויים כדי להדביק אותם זה לזה. לאחר הייבוש, צבעו את כל הקצוות של הכיסויים כדי לאטום אותם. הימנעו תחילה מציפוי כל הקצוות, שכן לעתים קרובות זה יכול להזיז את הכיסוי ולפגוע ברקמת הגב. דמיינו את הנוטום תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ראו טבלת חומרים) דרך הצד הגבי ו/או הגחון.