Summary

טיפול פוטודינמי בתיווך רוז בנגל לעיכוב קנדידה אלביקנס

Published: March 24, 2022
doi:

Summary

השכיחות הגוברת של קנדידה אלביקנס עמידים לתרופות היא בעיה בריאותית חמורה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע אסטרטגיה למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את יעילות ה-aPDT בתיווך בנגל רוז על זן C. albicans עמיד בפני multidrug במבחנה.

Abstract

זיהום קנדידה אלביקנס פולשני הוא זיהום פטרייתי אופורטוניסטי משמעותי בבני אדם מכיוון שהוא אחד המתיישבים הנפוצים ביותר במעיים, בפה, בנרתיק ובעור. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, שיעור התמותה של קנדידה פולשנית נותר כ -50%. למרבה הצער, השכיחות של C. albicans עמידים לתרופות עולה ברחבי העולם. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) עשוי להציע טיפול חלופי או אדג’ובנטי כדי לעכב את היווצרות הביופילם של C. albicans ולהתגבר על עמידות לתרופות. APDT בתיווך רוז בנגל (RB) הראה הרג יעיל של תאים של חיידקים ושל C. albicans. במחקר זה מתוארת היעילות של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג. מקור אור ביתי של דיודה ירוקה פולטת אור ירוק (LED) מתוכנן להתיישר עם מרכזה של באר של צלחת בעלת 96 בארות. השמרים דוגרו בבארות עם ריכוזים שונים של RB והוארו בפלואנסים משתנים של אור ירוק. השפעות ההרג נותחו בשיטת דילול הצלחת. עם שילוב אופטימלי של אור ו- RB, הושגה עיכוב צמיחה של 3 לוגים. הוסק כי RB-aPDT עשוי לעכב C. albicans עמידים לתרופות.

Introduction

C. albicans מתיישבת במערכת העיכול ובמערכת העיכול והגניטורין של אנשים בריאים וניתן לזהות אותה כמיקרוביוטה רגילה בכ-50 אחוז מהאנשים1. אם נוצר חוסר איזון בין הפונדקאי לפתוגן, C. albicans מסוגל לפלוש ולגרום למחלות. הזיהום יכול לנוע בין זיהומים ריריים מקומיים בממברנה ועד לכשל איברים מרובים2. במחקר מעקב רב-מרכזי בארה”ב, כמחצית מהמבודדים מחולים עם קנדידה פולשנית בין 2009 ל-2017 הם C. albicans3. קנדידמיה יכולה להיות קשורה לשיעורי תחלואה גבוהים, תמותה, שהייה ממושכת בבית החולים4. המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארה”ב דיווחו כי כ-7% מכל דגימות הדם של קנדידה שנבדקו עמידות לתרופה האנטי-פטרייתית fluconazole5. הופעתם של מיני קנדידה עמידים לתרופות מעלה את החשש לפתח טיפול חלופי או אדג’ובנטי לחומרים אנטי-מיקוטיים.

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) כולל הפעלת פוטוס-סנסיטיזר ספציפי (PS) עם אור באורך הגל של שיא הקליטה של ה-PS6. לאחר העירור, PS הנרגש מעביר את האנרגיה או האלקטרונים שלו למולקולות החמצן הסמוכות וחוזר למצב הקרקע. במהלך תהליך זה נוצרים מיני חמצן תגובתי וחמצן סינגלט וגורמים נזק לתאים. aPDT נמצא בשימוש נרחב כדי להרוג מיקרואורגניזמים מאז שנות ה-90של המאה ה-20. אחד היתרונות של aPDT הוא שמספר אברונים ניזוקים בתא על ידי חמצן יחיד ו/או מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך הקרנה; לפיכך, ההתנגדות ל-aPDT לא נמצאה עד היום. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה דיווח כי החיידקים ששרדו לאחר aPDT נעשו רגישים יותר לאנטיביוטיקה8.

מקורות האור המשמשים ב-aPDT כוללים לייזרים, מנורות הלוגן מתכתיות עם מסננים, אור אינפרה-אדום קרוב ודיודה פולטת אור (LED)9,10,11,12. הלייזר מספק עוצמת אור גבוהה, בדרך כלל גדולה מ-0.5 W/cm2, המאפשרת אספקה של מינון אור גבוה בזמן קצר מאוד. זה כבר בשימוש נרחב במקרים שבהם זמן טיפול ארוך יותר אינו נוח כגון aPDT עבור זיהומים דרך הפה. החיסרון של לייזר הוא שגודל התאורה הנקודתי שלו קטן, ונע בין כמה מאות מיקרומטרים ל -10 מ”מ עם מפזר. יתר על כן, ציוד לייזר הוא יקר וזקוק להכשרה ספציפית כדי לפעול. מצד שני, שטח ההקרנה של מנורת הלוגן מתכתית עם פילטרים גדול יחסית13. עם זאת, המנורה חסונה ויקרה מדי. מקורות אור LED הפכו למיינסטרים של aPDT בתחום הדרמטולוגי מכיוון שהוא קטן וזול יותר. שטח ההקרנה יכול להיות גדול יחסית עם סידור מערך של נורת ה-LED. ניתן להאיר את כל הפנים בו זמנית9. עם זאת, רוב, אם לא כל, מקורות תאורת ה-LED הזמינים כיום מיועדים לשימוש קליני. זה לא יכול להיות מתאים לניסויים במעבדה כי זה תופס מקום ויקר. פיתחנו מערך LED זול שהוא קטן מאוד וניתן לחתוך ולהרכיב אותו מרצועת LED. ניתן להתאים את נוריות ה- LED לסידורים שונים עבור עיצובים ניסיוניים שונים. ניתן להשלים תנאים שונים של aPDT בצלחת של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.

ורד בנגל (RB) הוא צבע צבעוני הנמצא בשימוש נרחב להגברת ההדמיה של נזקי הקרנית בעיני אדם14. aPDT בתיווך RB הראה השפעות הרג על סטפילוקוקוס אאורוס, Escherichia coli ו- C. albicans עם יעילות דומה פחות או יותר לזו של טולואידין כחול O15. מחקר זה מדגים שיטה לאימות ההשפעה של RB-aPDT על C. albicans עמידים למולטי-דרוג.

Protocol

1. הכנת מערכת aPDT חותכים ארבע דיודות פולטות אור ירוק (נוריות LED) מרצועת LED (ראו טבלת חומרים) ומיישרים אותן עם ארבע בארות של לוחית בעלת 96 בארות (איור 1).הערה: נוריות ה-LED סודרו במערך של 4 x 3. החלק האחורי של הנורית הודבק לגוף קירור כדי לפזר חום במהלך ההקרנה.</li…

Representative Results

איור 1 מראה את מערכת ה-aPDT שבה נעשה שימוש במחקר הנוכחי. מכיוון שטמפרטורות גבוהות עלולות לגרום למוות תאי משמעותי, מערך ה-LED מקורר על ידי מאוורר חשמלי, וגוף קירור משמש במהלך הקרנה כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 25 ± 1 °C (74 °F). ניתן לזלזל באפקט החום. התפלגות אור אחידה היא גם גורם מכר…

Discussion

תוצאות מעודדות של יישומים קליניים של RB-PDT עבור קרטיטיס פטרייתית דווחו לאחרונה19. שיא הספיגה של RB הוא ב 450-650 ננומטר. חיוני לקבוע את קצב הפלואנס של מקור האור עבור aPDT מוצלח. פלואנס גבוה (בדרך כלל >100 J/cm2) נדרש לטיפול בתאים סרטניים, בעוד פלואנס נמוך יותר צפוי לטפל בנגעים נגועים<sup …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה מימון מהמרכז לננו-רפואה יישומית, אוניברסיטת צ’נג קונג הלאומית מתוכנית מרכז המחקר לאזורים נבחרים במסגרת פרויקט הנבטים להשכלה גבוהה על ידי משרד החינוך (MOE), ומשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן [MOST 109-2327-B-006-005] ל- TW וונג. J.H. Hung מכיר במימון מבית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ’נג קונג, טייוואן [NCKUH-11006018], ו[MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Materials

1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Falcon, USA #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Aluminum foil sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan BK-T220-0051-01
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R disperses heat from the LED array
Graph pad prism software GraphPad 8.0, San Diego, California, USA graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan 2835
Incubator Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R) Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Light power meter Ophir, Jerusalem, Israel PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter Merck, NJ, USA SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan BCRC 21538/ATCC 10231 http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, MO, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

References

  1. Naglik, J. R., Challacombe, S. J., Hube, B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 400-428 (2003).
  2. Pappas, P. G., et al. Clinical practice guideline for the management of candidiasis: 2016 update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 62 (4), 1-50 (2016).
  3. Ricotta, E. E., et al. Invasive candidiasis species distribution and trends, United States, 2009-2017. Journal of Infectious Diseases. 223 (7), 1295-1302 (2021).
  4. Koehler, P., et al. Morbidity and mortality of candidaemia in Europe: an epidemiologic meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection. 25 (10), 1200-1212 (2019).
  5. Toda, M., et al. Population-based active surveillance for culture-confirmed candidemia – four sites, United States, 2012-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report Surveillance Summaries. 68 (8), 1-15 (2019).
  6. Lee, C. N., Hsu, R., Chen, H., Wong, T. W. Daylight photodynamic therapy: an update. Molecules. 25 (21), 5195 (2020).
  7. Wainwright, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 42 (1), 13-28 (1998).
  8. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant staphylococcus aureus drug resistance. Journal of Clinical Medicine. 8 (3), 411 (2019).
  9. Kim, M. M., Darafsheh, A. Light sources and dosimetry techniques for photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 280-294 (2020).
  10. Wong, T. W., Sheu, H. M., Lee, J. Y., Fletcher, R. J. Photodynamic therapy for Bowen’s disease (squamous cell carcinoma in situ) of the digit. Dermatologic Surgery. 27 (5), 452-456 (2001).
  11. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dermatologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  12. Stasko, N., et al. Visible blue light inhibits infection and replication of SARS-CoV-2 at doses that are well-tolerated by human respiratory tissue. Scientific Reports. 11 (1), 20595 (2021).
  13. Crosbie, J., Winser, K., Collins, P. Mapping the light field of the Waldmann PDT 1200 lamp: potential for wide-field low light irradiance aminolevulinic acid photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 76 (2), 204-207 (2002).
  14. Feenstra, R. P., Tseng, S. C. Comparison of fluorescein and rose bengal staining. Ophthalmology. 99 (4), 605-617 (1992).
  15. Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Effect of cell-photosensitizer binding and cell density on microbial photoinactivation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (6), 2329-2335 (2005).
  16. Shahid, H., et al. Duclauxin derivatives from fungi and their biological activities. Frontiers in Microbiology. 12, 766440 (2021).
  17. Arendrup, M. C., Park, S., Brown, S., Pfaller, M., Perlin, D. S. Evaluation of CLSI M44-A2 disk diffusion and associated breakpoint testing of caspofungin and micafungin using a well-characterized panel of wild-type and fks hot spot mutant Candida isolates. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (5), 1891-1895 (2011).
  18. Mukaremera, L., Lee, K. K., Mora-Montes, H. M., Gow, N. A. R. Candida albicans yeast, pseudohyphal, and hyphal morphogenesis differentially affects immune recognition. Frontiers in Immunology. 8, 629 (2017).
  19. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).
  20. Martinez, J. D., et al. Rose Bengal photodynamic antimicrobial therapy: a pilot safety study. Cornea. 40 (8), 1036-1043 (2021).

Play Video

Cite This Article
Hung, J., Wang, Z., Lo, Y., Lee, C., Chang, Y., Chang, R. Y., Huang, C., Wong, T. Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans. J. Vis. Exp. (181), e63558, doi:10.3791/63558 (2022).

View Video