Summary

Un modelo de roedor inducido por TNBS para estudiar el papel patogénico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn

Published: March 01, 2022
doi:

Summary

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo de colitis similar a la enfermedad de Crohn en roedores. La inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS, y se observa agrandamiento mecánico en el segmento proximal a la estenosis. Estos cambios permiten estudiar el estrés mecánico en la colitis.

Abstract

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) son trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal que afectan aproximadamente a 20 por cada 1,00,000 en Europa y Estados Unidos. La EC se caracteriza por inflamación transmural, fibrosis intestinal y estenosis luminal. Aunque las terapias antiinflamatorias pueden ayudar a controlar la inflamación, no tienen eficacia en la fibrosis y la estenosis en la EC. La patogénesis de la EC no se entiende bien. Los estudios actuales se centran principalmente en delinear los mecanismos desregulados de la respuesta inmune intestinal. Si bien la inflamación transmural asociada a la EC, la fibrosis intestinal y la estenosis luminal representan estrés mecánico en la pared intestinal, el papel del estrés mecánico en la EC no está bien definido. Para determinar si el estrés mecánico desempeña un papel patógeno independiente en la EC, se ha desarrollado un protocolo de modelo de colitis similar a la EC inducido por TNBS en roedores. Este modelo de inflamación transmural y fibrosis inducida por TNBS se asemeja a las características patológicas de la EC en el colon. Es inducida por la instilación intracolonica de TNBS en el colon distal de ratas Sprague-Dawley adultas. En este modelo, la inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS (Sitio I). La distensión mecánica se observa en la porción proximal al sitio de instilación (Sitio P), lo que representa estrés mecánico pero no inflamación visible. La porción colónica distal a la inflamación (Sitio D) no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios distintivos de la expresión génica, la respuesta inmune, la fibrosis y el crecimiento del músculo liso en diferentes sitios (P, I y D), destacando un profundo impacto del estrés mecánico. Por lo tanto, este modelo de colitis similar a la EC nos ayudará a comprender mejor los mecanismos patógenos de la EC, particularmente el papel del estrés mecánico y la expresión génica inducida por el estrés mecánico en la desregulación inmune, la fibrosis intestinal y la remodelación de tejidos en la EC.

Introduction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluida la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), se caracteriza por una inflamación crónica en el tracto gastrointestinal (GI). Afecta a ~1-2 millones de estadounidenses1. Los costos anuales estimados para la atención de la EII en los Estados Unidos son de $ 11.8 mil millones. A diferencia de la CU, la EC se caracteriza por inflamación transmural y formación deestenosis 2,3. La formación de estenosis (estenosis) ocurre en hasta el 70% de los pacientes con EC3 y puede ser causada por inflamación transmural (estenosis inflamatoria) o fibrosis intestinal (estenosis fibrótica)4,5. La fibrosis intestinal se caracteriza por una deposición excesiva de colágeno y otras matrices extracelulares (ECM) con células del músculo liso (SMC) como uno de los principales tipos de células mesenquimales implicadas en el proceso 3,4. La hiperplasia del músculo liso asociada con hipertrofia es otro cambio histológico significativo en la estenosis fibrótica en laEC 6. Aunque la formación de estenosis en la EC se asocia con inflamación crónica, ningún tratamiento antiinflamatorio es efectivo, excepto el tratamiento quirúrgico 2,6. Sin embargo, las recurrencias postquirúrgicas son casi del 100%, dado el tiempo suficiente 2,7. Como respuesta inflamatoria, la fibrosis y la hiperplasia SMC también pueden desarrollarse en condiciones no inflamatorias (es decir, obstrucción intestinal) en el intestino 8,9; se cree que tanto los mecanismos dependientes de la inflamación como los independientes están involucrados en la formación deestenosis 3,4. Dado que la extensa investigación sobre los mecanismos dependientes de la inflamación no se ha traducido en ninguna terapia efectiva para la formación de estenosis, se necesitan estudios sobre el posible papel de los mecanismos independientes de la inflamación en la fibrosis intestinal.

Como factor no inflamatorio, el estrés mecánico (EM) asociado con edema, infiltración de células inflamatorias, deformación tisular, fibrosis y estenosis 10,11,12,13 se encuentra comúnmente en la EII, especialmente la EC, que se caracteriza por inflamación transmural. El estrés mecánico es más notable en la EC estenótica, donde la estenosis (inflamatoria o fibrótica) en el sitio de inflamación presenta estrés mecánico en el tejido local y conduce a la distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de obstrucción10,14. Estudios previos in vitro han demostrado que el estrés mecánico altera la expresión génica de mediadores inflamatorios específicos (es decir, COX-2, IL-6)8,14,15 y factores de crecimiento (es decir, TGF-β) en los tejidos gastrointestinales, especialmente las células del músculo liso intestinal (SMC)16. Estudios recientes también encontraron que la expresión de mediadores profibróticos específicos como el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es altamente sensible al estrés mecánico17,18. Se planteó la hipótesis de que el estrés mecánico podría desempeñar un papel patógeno independiente en la inflamación asociada a la EC, la fibrosis y la remodelación de los tejidos. Sin embargo, la importancia patogénica del estrés mecánico en la inflamación intestinal, la fibrosis y la hiperplasia del músculo liso en la EC permanece en gran medida inexplorada. Esto puede deberse en parte a que la inflamación es un proceso más visible y mejor estudiado que el estrés mecánico. Más importante aún, no ha habido un modelo animal bien definido de EII para distinguir el efecto del estrés mecánico del de la inflamación.

El presente trabajo describe un modelo de roedor de colitis similar a la enfermedad de Crohn inducida por inyección intracolínica del reactivo de hapteno ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS)19,20, que puede servir para estudiar el papel del estrés mecánico en la EC. Se encontró que la instilación de TNBS indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con estrechamiento de la luz (estenosis) en el colon distal. La estenosis conduce a una marcada distensión intestinal (estrés mecánico)14,15 pero no a una inflamación visible en el segmento colónico proximal al sitio de instilación. Por el contrario, el segmento del colon distal al sitio de estenosis no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios significativos específicos del sitio en la expresión génica, la inflamación, la fibrosis y la hiperplasia SMC en los tres sitios diferentes. Los resultados sugieren que el estrés mecánico, particularmente la expresión génica inducida por el estrés mecánico, puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de fibrosis e hiperplasia en la colitis de Crohn.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas (#0907051C). Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho o hembra, de ~ 8-9 semanas de edad, para el estudio. 1. Preparación animal Ayuna a las ratas durante 24 horas y trátalas con laxante (limpiador intestinal, ver Tabla de materiales) durante la noche. Al día siguiente, …

Representative Results

Visión macroscópica de la colitis similar a la de Crohn inducida por la instilación intracolónica de TNBSComo se muestra en la Figura 1, la instilación intracolónica de TNBS en ratas indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con pared intestinal engrosada y lumen estrechado (estenosis) en el sitio de instilación en el colon distal (Figura 1A). El sitio de instilación de TNBS se conoce como sitio I. Como resul…

Discussion

La colitis inducida por TNBS se introdujo en 1989 y se ha utilizado como modelo experimental de la enfermedad de Crohn desde entonces 19,20,23. Las características significativas de este modelo en roedores incluyen el desarrollo de una inflamación transmural que se asemeja mucho a las lesiones histopatológicas desarrolladas en la enfermedad de Crohn humana19,20. Estud…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado en parte por subvenciones de NIH (R01 DK124611 a XZS) y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH-20-1-0681 a XZS). El trabajo de histología se realizó con la ayuda del Laboratorio de Patología Quirúrgica de UTMB.

Materials

ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers
QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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Cite This Article
Geesala, R., Lin, Y., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn’s Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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