Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen
Summary
Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een Crohn-achtig colitismodel bij knaagdieren. Transmurale ontsteking leidt tot stenose op de TNBS-instillatieplaats en mechanische vergroting wordt waargenomen in het segment proximaal met de stenose. Deze veranderingen maken het mogelijk om mechanische stress bij colitis te bestuderen.
Abstract
Inflammatoire darmziekten (IBD) zoals de ziekte van Crohn (CD) zijn chronische ontstekingsaandoeningen van het maagdarmkanaal die ongeveer 20 per 1.00.000 in Europa en de VS beïnvloeden. CD wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose. Hoewel ontstekingsremmende therapieën kunnen helpen bij het beheersen van ontstekingen, hebben ze geen werkzaamheid op fibrose en stenose in CD. De pathogenese van CD is niet goed begrepen. Huidige studies richten zich voornamelijk op het afbakenen van ontregelde immuunresponsmechanismen van de darm. Hoewel CD-geassocieerde transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose allemaal mechanische stress op de darmwand vertegenwoordigen, is de rol van mechanische stress in CD niet goed gedefinieerd. Om te bepalen of mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol speelt bij CD, is een protocol van TNBS-geïnduceerd CD-achtig colitismodel bij knaagdieren ontwikkeld. Dit TNBS-geïnduceerde transmurale ontstekings- en fibrosemodel lijkt op pathologische kenmerken van CD in de dikke darm. Het wordt geïnduceerd door intrakolonische instillatie van TNBS in de distale dikke darm van volwassen Sprague-Dawley-ratten. In dit model leidt transmurale ontsteking tot stenose op de TNBS-instillatieplaats (site I). Mechanische uitzetting wordt waargenomen in het gedeelte proximaal tot de instillatieplaats (site P), wat mechanische stress vertegenwoordigt, maar geen zichtbare ontsteking. Colongedeelte distale tot ontsteking (site D) presenteert geen ontsteking of mechanische stress. Onderscheidende veranderingen van genexpressie, immuunrespons, fibrose en gladde spiergroei op verschillende plaatsen (P, I en D) werden waargenomen, wat een diepgaande impact van mechanische stress benadrukte. Daarom zal dit model van CD-achtige colitis ons helpen de pathogene mechanismen van CD beter te begrijpen, met name de rol van mechanische stress en mechanische stress-geïnduceerde genexpressie bij immuunontregeling, darmfibrose en weefselremodellering in CD.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD), wordt gekenmerkt door chronische ontsteking in het maagdarmkanaal (GI). Het treft ~ 1-2 miljoen Amerikanen1. De geschatte jaarlijkse kosten voor IBD-zorg in de VS zijn $ 11,8 miljard. In tegenstelling tot UC wordt de CD gekenmerkt door transmurale ontsteking en strictuurvorming 2,3. Strictuurvorming (stenose) komt voor bij maximaal 70% van de CD-patiënten3 en kan worden veroorzaakt door transmurale ontsteking (inflammatoire stenose) of darmfibrose (fibrotische stenose)4,5. Darmfibrose wordt gekenmerkt door overmatige collageenafzetting en andere extracellulaire matrices (ECM) met gladde spiercellen (SMC) als een van de belangrijkste mesenchymale celtypen die betrokken zijn bij het proces 3,4. Gladde spierhyperplasie geassocieerd met hypertrofie is een andere significante histologische verandering in fibrotische stenose bij CD6. Hoewel strictuurvorming in CD geassocieerd is met chronische ontsteking, is geen ontstekingsremmende behandeling effectief, behalve chirurgische behandeling 2,6. Postoperatieve recidieven zijn echter bijna 100%, mits voldoende tijd 2,7. Als ontstekingsreactie kunnen fibrose en SMC-hyperplasie zich ook ontwikkelen bij niet-inflammatoire aandoeningen (d.w.z. darmobstructie) in de darm 8,9; er wordt aangenomen dat zowel ontstekingsafhankelijke als onafhankelijke mechanismen betrokken zijn bij strictuurvorming 3,4. Aangezien uitgebreid onderzoek naar de ontstekingsafhankelijke mechanismen zich niet heeft vertaald in een effectieve therapie voor strictuurvorming, zijn studies nodig naar de mogelijke rol van ontstekingsonafhankelijke mechanismen bij darmfibrose.
Als een niet-inflammatoire factor wordt mechanische stress (MS) geassocieerd met oedeem, inflammatoire celinfiltratie, weefselvervorming, fibrose en stenose 10,11,12,13 vaak aangetroffen bij IBD, vooral CD, die wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking. Mechanische stress is het meest opmerkelijk bij stenotische CD, waar stenose (inflammatoir of fibrotisch) op de ontstekingsplaats mechanische stress in het lokale weefsel presenteert en leidt tot lumenuitzetting in het segment proximaal tot de obstructieplaats 10,14. Eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat mechanische stress de genexpressie van specifieke ontstekingsmediatoren (d.w.z. COX-2, IL-6)8,14,15 en groeifactoren (d.w.z. TGF-β) in de gastro-intestinale weefsels, met name darm gladde spiercellen (SMC)16, verandert. Recente studies toonden ook aan dat de expressie van specifieke pro-fibrotische mediatoren zoals bindweefselgroeifactor (CTGF) zeer gevoelig is voor mechanische stress 17,18. Er werd verondersteld dat mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol zou kunnen spelen bij CD-geassocieerde ontsteking, fibrose en weefselremodellering. De pathogene betekenis van mechanische stress bij darmontsteking, fibrose en gladde spierhyperplasie bij CD blijft echter grotendeels onontgonnen. Dit kan deels komen doordat ontsteking een zichtbaarder en beter bestudeerd proces is dan mechanische stress. Wat nog belangrijker is, er is geen goed gedefinieerd diermodel van IBD om het effect van mechanische stress te onderscheiden van dat van ontsteking.
Het huidige werk beschrijft een knaagdiermodel van Crohn-achtige colitis geïnduceerd door intrakolonische injectie van haptenreagens 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)19,20, dat het doel kan dienen om de rol van mechanische stress in CD te bestuderen. Het bleek dat TNBS-instillatie een gelokaliseerde (~ 2 cm lengte) transmurale ontsteking veroorzaakte met lumenvernauwing (stenose) in de distale dikke darm. De stenose leidt tot duidelijke darmuitzetting (mechanische stress)14,15 maar niet zichtbare ontsteking in het colonsegment proximaal tot de instillatieplaats. Integendeel, het colonsegment distale naar de stenoseplaats vertoont geen ontsteking of mechanische stress. Significante site-specifieke veranderingen in genexpressie, ontsteking, fibrose en SMC-hyperplasie werden waargenomen op de drie verschillende locaties. De resultaten suggereren dat mechanische stress, met name mechanische stress-geïnduceerde genexpressie, een cruciale rol kan spelen bij het ontwikkelen van fibrose en hyperplasie bij colitis van Crohn.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-geïnduceerde colitis werd geïntroduceerd in 1989 en wordt sindsdien gebruikt als een experimenteel model van de ziekte van Crohn 19,20,23. Belangrijke kenmerken van dit model bij knaagdieren zijn de ontwikkeling van een transmurale ontsteking die sterk lijkt op de histopathologische laesies die zijn ontwikkeld bij de ziekte van Crohn bij de mens19,20. Eerdere stud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH (R01 DK124611 aan XZS) en het Amerikaanse ministerie van Defensie (W81XWH-20-1-0681 aan XZS). Het histologische werk werd gedaan met de hulp van het UTMB Surgical Pathology Lab.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
