Summary

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Published: March 01, 2022
doi:

Summary

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Abstract

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Introduction

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)4,5. A fibrose intestinal é caracterizada pela deposição excessiva de colágeno e outras matrizes extracelulares (ECM) com células musculares lisas (SMC) como um dos principais tipos de células mesenquimais envolvidas no processo 3,4. A hiperplasia muscular lisa associada à hipertrofia é outra mudança histológica significativa na estenose fibrosa no CD6. Embora a formação de rigor em CD esteja associada à inflamação crônica, nenhum tratamento anti-inflamatório é eficaz, exceto o tratamento cirúrgico 2,6. No entanto, as recidivas pós-cirurgia são quase 100%, dado tempo suficiente 2,7. Como resposta inflamatória, a fibrose e a hiperplasia SMC também podem desenvolver-se em condições não inflamatórias (ou seja, obstrução intestinal) no intestino 8,9; acredita-se que tanto mecanismos dependentes da inflamação quanto independentes estejam envolvidos na formação rigorosa 3,4. Dado que uma extensa pesquisa sobre os mecanismos dependentes da inflamação não se traduziu em nenhuma terapia eficaz para a formação de estritos, são necessários estudos sobre o possível papel de mecanismos independentes da inflamação na fibrose intestinal.

Como fator não inflamatório, o estresse mecânico (EM) associado ao edema, infiltração de células inflamatórias, deformação tecidual, fibrose e estenose 10,11,12,13 é comumente encontrado no DIB, especialmente o CD, que é caracterizado por inflamação transmural. O estresse mecânico é mais notável no CD estenético, onde a estenose (inflamatória ou fibrosa) no local da inflamação apresenta estresse mecânico no tecido local e leva à distensão do lúmen no segmento proximal ao local da obstrução10,14. Estudos in vitro anteriores demonstraram que o estresse mecânico altera a expressão genética de mediadores inflamatórios específicos (ou seja, COX-2, IL-6)8,14,15 e fatores de crescimento (ou seja, TGF-β) nos tecidos gastrointestinais, especialmente células musculares lisas do intestino (SMC)16. Estudos recentes também descobriram que a expressão de mediadores pró-fibrosos específicos, como o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é altamente sensível ao estresse mecânico17,18. Foi a hipótese de que o estresse mecânico poderia desempenhar um papel patogênico independente na inflamação associada ao CD, fibrose e remodelagem tecidual. No entanto, a significância patogênica do estresse mecânico na inflamação intestinal, fibrose e hiperplasia muscular lisa em CD permanece em grande parte inexplorada. Isso pode ser em parte porque a inflamação é um processo mais visível e melhor estudado do que o estresse mecânico. Mais importante, não houve nenhum modelo animal bem definido de IBD para distinguir o efeito do estresse mecânico do da inflamação.

O trabalho atual descreve um modelo de roedor da colite semelhante a Crohn induzida pela injeção intracolônica de reagente hapten 2,4,6-6-trinitrobenzeno ácido sulfônico (TNBS)19,20, que pode servir para estudar o papel do estresse mecânico em CD. Verificou-se que a instilação TNBS induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com estreitamento de lúmen (estenose) no cólon distal. A estenose leva à distensão intestinal marcada (estresse mecânico)14,15, mas não inflamação visível no segmento cólon proximal ao local de instilação. Pelo contrário, o segmento de cólon distal ao local da estenose não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações significativas na expressão genética, inflamação, fibrose e hiperplasia SMC nos três locais diferentes. Os resultados sugerem que o estresse mecânico, particularmente a expressão genética induzida pelo estresse mecânico, pode desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de fibrose e hiperplasia na colite de Crohn.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo. 1. Preparação animal Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite. No dia seguinte, anestesiam ra…

Representative Results

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBSComo mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transm…

Discussion

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sob…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.

Materials

ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers
QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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Cite This Article
Geesala, R., Lin, Y., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn’s Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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