En TNBS-induceret gnavermodel til undersøgelse af den patogene rolle af mekanisk stress i Crohns sygdom
Summary
Den nuværende protokol beskriver udviklingen af en Crohns-lignende colitis-model hos gnavere. Transmural inflammation fører til stenose på TNBS-instillationsstedet, og mekanisk forstørrelse observeres i segmentet proksimalt til stenose. Disse ændringer gør det muligt at studere mekanisk belastning i colitis.
Abstract
Inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) såsom Crohns sygdom (CD) er kroniske inflammatoriske lidelser i mave-tarmkanalen, der påvirker ca. 20 pr. 1.00.000 i Europa og USA. CD er kendetegnet ved transmural inflammation, intestinal fibrose og luminal stenose. Selvom antiinflammatoriske terapier kan hjælpe med at kontrollere inflammation, har de ingen effekt på fibrose og stenose i CD. Patogenesen af CD er ikke godt forstået. Nuværende undersøgelser fokuserer primært på at afgrænse dysregulerede tarmimmunresponsmekanismer. Mens CD-associeret transmural inflammation, intestinal fibrose og luminal stenose alle repræsenterer mekanisk belastning på tarmvæggen, er rollen som mekanisk belastning i CD ikke veldefineret. For at afgøre, om mekanisk belastning spiller en uafhængig patogen rolle i CD, er der udviklet en protokol med TNBS-induceret CD-lignende colitismodel hos gnavere. Denne TNBS-inducerede transmurale inflammation og fibrose model ligner patologiske kendetegn ved CD i tyktarmen. Det induceres af intrakolonisk indånding af TNBS i den distale tyktarm hos voksne Sprague-Dawley-rotter. I denne model fører transmural inflammation til stenose på TNBS-instillationsstedet (Site I). Mekanisk afstand observeres i den del, der er proksimal til instillationsstedet (Site P), hvilket repræsenterer mekanisk belastning, men ikke synlig betændelse. Colonic del distal til betændelse (Site D) præsenterer hverken betændelse eller mekanisk stress. Særlige ændringer af genekspression, immunrespons, fibrose og glat muskelvækst på forskellige steder (P, I og D) blev observeret, hvilket fremhævede en dybtgående virkning af mekanisk stress. Derfor vil denne model af CD-lignende colitis hjælpe os med bedre at forstå CD’s patogene mekanismer, især rollen som mekanisk stress og mekanisk stressinduceret genekspression i immundysregulering, tarmfibrose og vævsombygning i CD.
Introduction
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), herunder ulcerøs colitis (UC) og Crohns sygdom (CD), er karakteriseret ved kronisk betændelse i mave-tarmkanalen (GI). Det påvirker ~ 1-2 millioner amerikanere1. De anslåede årlige omkostninger til IBD-pleje i USA er 11,8 milliarder dollars. I modsætning til UC er cd’en karakteriseret ved transmural inflammation og strikturdannelse 2,3. Strikturdannelse (stenose) forekommer hos op til 70 % af CD-patienterne3 og kan være forårsaget af transmural inflammation (inflammatorisk stenose) eller tarmfibrose (fibrotisk stenose)4,5. Tarmfibrose er karakteriseret ved overdreven kollagenaflejring og andre ekstracellulære matricer (ECM) med glatte muskelceller (SMC) som en af de vigtigste mesenkymale celletyper, der er involveret i processen 3,4. Glat muskelhyperplasi forbundet med hypertrofi er en anden signifikant histologisk ændring i fibrotisk stenose i CD6. Selvom strikturdannelse i CD er forbundet med kronisk inflammation, er ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, undtagen kirurgisk behandling 2,6. Imidlertid er tilbagefald efter operationen næsten 100%, givet tilstrækkelig tid 2,7. Som en inflammatorisk reaktion kan fibrose og SMC hyperplasi også udvikle sig under ikke-inflammatoriske tilstande (dvs. tarmobstruktion) i tarmen 8,9; det antages, at både inflammationsafhængige og uafhængige mekanismer er involveret i strikturdannelse 3,4. I betragtning af at omfattende forskning i de inflammationsafhængige mekanismer ikke har oversat til nogen effektiv terapi til strikturdannelse, er der behov for undersøgelser af den mulige rolle inflammationsuafhængige mekanismer i tarmfibrose.
Som en ikke-inflammatorisk faktor er mekanisk stress (MS) forbundet med ødem, inflammatorisk celleinfiltration, vævsdeformation, fibrose og stenose 10,11,12,13 almindeligt forekommende i IBD, især CD, som er karakteriseret ved transmural inflammation. Mekanisk belastning er mest bemærkelsesværdig i stenotisk CD, hvor stenose (inflammatorisk eller fibrotisk) på inflammationsstedet præsenterer mekanisk belastning i det lokale væv og fører til lumen-afstand i segmentet proksimalt til obstruktionsstedet10,14. Tidligere in vitro-undersøgelser har vist, at mekanisk stress ændrer genekspressionen af specifikke inflammatoriske mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 og vækstfaktorer (dvs. TGF-β) i mave-tarmvævene, især tarmglate muskelceller (SMC)16. Nylige undersøgelser viste også, at ekspressionen af specifikke profibrotiske mediatorer såsom bindevævsvækstfaktor (CTGF) er meget følsom over for mekanisk belastning17,18. Det blev antaget, at mekanisk stress kan spille en uafhængig patogen rolle i CD-associeret inflammation, fibrose og vævsombygning. Imidlertid forbliver den patogene betydning af mekanisk stress i tarmbetændelse, fibrose og glat muskelhyperplasi i CD stort set uudforsket. Dette kan blandt andet skyldes, at inflammation er en mere synlig og bedre undersøgt proces end mekanisk belastning. Endnu vigtigere har der ikke været nogen veldefineret dyremodel af IBD til at skelne effekten af mekanisk belastning fra inflammation.
Det nuværende arbejde beskriver en gnavermodel af Crohns-lignende colitis induceret af intrakolonisk injektion af haptenreagens 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS)19,20, som kan tjene formålet med at studere rollen som mekanisk belastning i CD. Det blev konstateret, at TNBS-instillation inducerede en lokaliseret (~ 2 cm lang) transmural betændelse med lumenindsnævring (stenose) i den distale tyktarm. Stenose fører til markant tarmdistention (mekanisk belastning)14,15, men ikke synlig betændelse i tyktarmssegmentet proksimalt til indåndingsstedet. Tværtimod præsenterer tyktarmssegmentet distalt til stenosestedet hverken betændelse eller mekanisk belastning. Signifikante stedspecifikke ændringer i genekspression, inflammation, fibrose og SMC hyperplasi blev observeret på de tre forskellige steder. Resultaterne tyder på, at mekanisk stress, især mekanisk stressinduceret genekspression, kan spille en kritisk rolle i udviklingen af fibrose og hyperplasi i Crohns colitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-induceret colitis blev introduceret i 1989 og er blevet brugt som en eksperimentel model af Crohns sygdom siden da 19,20,23. Væsentlige træk ved denne model hos gnavere omfatter udviklingen af en transmural betændelse, der ligner de histopatologiske læsioner udviklet i human Crohns sygdom19,20. Tidligere undersøgelser af modellen har primært fokuseret på afvi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes delvist af bevillinger fra NIH (R01 DK124611 til XZS) og det amerikanske forsvarsministerium (W81XWH-20-1-0681 til XZS). Histologiarbejdet blev udført ved hjælp af UTMB Surgical Pathology Lab.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
