Summary

Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

Published: March 01, 2022
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Summary

Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Zusammenfassung der Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Am Beispiel der Pilze Verticillium longisporum und Verticillium dahliae werden drei verschiedene Wurzelinfektionssysteme beschrieben. Mögliche Anwendungen und mögliche nachgelagerte Analysen werden aufgezeigt und Vor- oder Nachteile für jedes System diskutiert.

Abstract

Die Rhizosphäre beherbergt eine hochkomplexe mikrobielle Gemeinschaft, in der Pflanzenwurzeln ständig herausgefordert werden. Wurzeln stehen in engem Kontakt mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, aber Studien über bodenbürtige Wechselwirkungen liegen immer noch hinter denen, die an oberirdischen Organen durchgeführt werden. Obwohl in der Literatur einige Impfstrategien zur Infektion von Modellpflanzen mit Modellwurzelpathogenen beschrieben werden, bleibt es schwierig, einen umfassenden methodischen Überblick zu erhalten. Um dieses Problem anzugehen, werden drei verschiedene Wurzelimpfsysteme genau beschrieben, die angewendet werden können, um Einblicke in die Biologie der Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu gewinnen. Zur Veranschaulichung wurden Verticillium-Arten (nämlich V. longisporum und V. dahliae) als wurzeleindringende Modellpathogene verwendet. Die Methoden können jedoch leicht an andere wurzelbesiedelnde Mikroben angepasst werden – sowohl pathogene als auch nützliche. Durch die Besiedlung der Pflanze Xylem zeigen bodengetragene Gefäßpilze wie Verticillium spp. einen einzigartigen Lebensstil. Nach der Wurzelinvasion breiten sie sich über die Xylemgefäße akropetisch aus, erreichen den Spross und lösen Krankheitssymptome aus. Drei repräsentative Pflanzenarten wurden als Modellwirte ausgewählt: Arabidopsis thaliana, wirtschaftlich wichtiger Raps (Brassica napus) und Tomate (Solanum lycopersicum). Es werden Schritt-für-Schritt-Protokolle gegeben. Es werden repräsentative Ergebnisse von Pathogenitätsassays, transkriptionellen Analysen von Markergenen und unabhängigen Bestätigungen durch Reporterkonstrukte gezeigt. Darüber hinaus werden die Vor- und Nachteile jedes Impfsystems gründlich diskutiert. Diese bewährten Protokolle können dabei helfen, Ansätze für Forschungsfragen zu Wurzel-Mikroben-Interaktionen bereitzustellen. Zu wissen, wie Pflanzen mit Mikroben im Boden umgehen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der Landwirtschaft.

Introduction

Natürliche Böden werden von einer erstaunlichen Anzahl von Mikroben bewohnt, die neutral, schädlich oder vorteilhaft für Pflanzen sein können1. Viele Pflanzenpathogene werden durch den Boden übertragen, umgeben die Wurzeln und greifen das unterirdische Organ an. Diese Mikroorganismen gehören zu einer Vielzahl von Kladen: Pilze, Oomyceten, Bakterien, Nematoden, Insekten und einige Viren 1,2. Sobald die Umweltbedingungen eine Infektion begünstigen, werden anfällige Pflanzen krank und die Ernteerträge sinken. Die Auswirkungen des Klimawandels, wie die globale Erwärmung und Wetterextreme, werden den Anteil bodenbürtiger Pflanzenpathogeneerhöhen 3. Daher wird es immer wichtiger, diese zerstörerischen Mikroben und ihre Auswirkungen auf die Lebens- und Futtermittelproduktion, aber auch auf natürliche Ökosysteme zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es mikrobielle Mutualisten im Boden, die eng mit den Wurzeln interagieren und das Wachstum, die Entwicklung und die Immunität der Pflanzen fördern. Wenn Pflanzen mit Krankheitserregern konfrontiert werden, können sie aktiv spezifische Gegner in der Rhizosphäre rekrutieren, die das Überleben des Wirts unterstützen können, indem sie Krankheitserreger unterdrücken 4,5,6,7. Mechanistische Details und Signalwege, die an vorteilhaften Wurzel-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind, sind jedoch oft noch unbekannt6.

Es ist daher wichtig, das allgemeine Verständnis der Wurzel-Mikroben-Wechselwirkungen zu erweitern. Zuverlässige Methoden zur Beimpfung von Wurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen sind notwendig, um Modellstudien durchzuführen und die Erkenntnisse in landwirtschaftliche Anwendungen zu überführen. Vorteilhafte Wechselwirkungen im Boden werden beispielsweise mit Serendipita indica (früher bekannt als Piriformospora indica), stickstoffbindendem Rhizobium spp. oder Mykorrhizapilzen untersucht, während bekannte bodenbürtige Pflanzenpathogene Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. und Verticillium spp.1 umfassen. Die beiden letzteren sind Pilzgattungen, die weltweit verbreitet sind und Gefäßerkrankungenverursachen 2. Verticillium spp. (Ascomycota) kann Hunderte von Pflanzenarten infizieren – hauptsächlich Dikotyledonen, einschließlich krautiger Einjähriger, holziger Stauden und vieler Kulturpflanzen 2,8. Hyphen von Verticillium treten in die Wurzel ein und wachsen sowohl interzellulär als auch intrazellulär in Richtung des zentralen Zylinders, um die Xylemgefäße zu besiedeln 2,9. In diesen Gefäßen bleibt der Pilz für den größten Teil seines Lebenszyklus. Da der Xylemsaft nährstoffarm ist und pflanzliche Abwehrstoffe trägt, muss sich der Pilz an diese einzigartige Umgebung anpassen. Dies wird durch die Sekretion von kolonisationsbezogenen Proteinen erreicht, die es dem Erreger ermöglichen, in seinem Wirt10,11 zu überleben. Nach Erreichen des Wurzelgefäßes kann sich der Pilz innerhalb der Xylemgefäße akropetal auf das Laub ausbreiten, was zu einer systemischen Besiedlung des Wirts 9,12 führt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Pflanze im Wachstum 9,10,13 negativ beeinflusst. Zum Beispiel treten Wachstumsverzögerung und gelbe Blätter sowie vorzeitige Seneszenz13,14,15,16 auf.

Ein Mitglied dieser Gattung ist Verticillium longisporum, das stark an brassicaceous Wirte wie den agronomisch wichtigen Raps, Blumenkohl und die Modellpflanze Arabidopsis thaliana12 angepasst ist. Mehrere Studien kombinierten V. longisporum und A. thaliana, um umfangreiche Einblicke in bodenbürtige Gefäßerkrankungen und die daraus resultierenden Wurzelabwehrreaktionenzu gewinnen 13,15,16,17. Mit dem Modellsystem V. longisporum / A. thaliana können einfache Empfindlichkeitstests durchgeführt werden und für beide Organismen stehen gut etablierte genetische Ressourcen zur Verfügung. Eng verwandt mit V. longisporum ist der Erreger Verticillium dahliae. Obwohl beide Pilzarten einen ähnlichen vaskulären Lebensstil und Invasionsprozess durchführen, sind ihre Vermehrungseffizienz von den Wurzeln bis zu den Blättern und die hervorgerufenen Krankheitssymptome bei A. thaliana unterschiedlich: Während V. longisporum normalerweise eine frühe Seneszenz induziert, führt eine Infektion mit V. dahliae zu welken18. Kürzlich wurden in einer methodischen Zusammenfassung verschiedene Wurzelimpfstrategien zur Infektion von A. thaliana mit V. longisporum oder V. dahliae vorgestellt, die bei der Planung von Versuchsaufbauten helfen19. Auf dem Feld verursacht V. longisporum gelegentlich erhebliche Schäden in der Rapsproduktion12, während V. dahliae ein sehr breites Wirtsspektrum hat, das mehrere Kulturarten wie Weinrebe, Kartoffel und Tomate8 umfasst. Dies macht beide Krankheitserreger wirtschaftlich interessant zu untersuchende Modelle.

So verwenden die folgenden Protokolle sowohl V. longisporum als auch V. dahliae als Modell-Wurzelpathogene, um mögliche Ansätze für Wurzelimpfungen zu veranschaulichen. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Raps (Brassica napus) und Tomaten (Solanum lycopersicum) wurden als Musterwirte ausgewählt. Detaillierte Beschreibungen der Methoden finden Sie im folgenden Text und im dazugehörigen Video. Vor- und Nachteile für jedes Impfsystem werden diskutiert. Zusammengenommen kann diese Protokollsammlung helfen, eine geeignete Methode für spezifische Forschungsfragen im Kontext von Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu identifizieren.

Protocol

1. Medien für Pilzkulturen und Pflanzenimpfsysteme Flüssige Kartoffeldextrose-Brühe (PDB): 21 g/L PDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zubereiten. Flüssige Czapek Dextrose Brühe (CDB): Bereiten Sie 42 g/L CDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zu. Medium für das Petrischalen-Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 1,5 g/L Murashige und Skoog-Medium (MS) und 8 g/L Agar in Reinstwasser vor.HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diese…

Representative Results

Nach dem Protokoll wurden die Pflanzen kultiviert und mit V. longisporum (Stamm Vl4325) oder V. dahliae (Isolat JR218) beimpft. Verschiedene Szenarien wurden entwickelt, um die Wirksamkeit zu beweisen und einige Fähigkeiten der gegebenen Protokolle hervorzuheben. Repräsentative Ergebnisse werden gezeigt. Die expressionale Induktion von Genen, die an der antimikrobiellen Indol-Glucosinolat-Biosynthese (IG) beteiligt si…

Discussion

Aufgrund der enormen Ertragseinbußen durch bodenbürtigePhytopathogene 1 ist eine Verbesserung der Anbaustrategien oder Nutzpflanzensorten erforderlich. Der begrenzte Einblick in die Pathogenese bodenbürtigerer Krankheiten behindert die Entwicklung resistenterer Pflanzen. Es müssen die zugrunde liegenden Pathomechanismen erforscht werden, für die eine robuste methodische Plattform erforderlich ist. Berichtete Impfverfahren haben gezeigt, dass multifaktorielle Ereignisse in Wurzel-Mikroben-Inte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Tim Iven und Jaqueline Komorek für ihre bisherigen Arbeiten zu diesen Methoden, der Gruppe von Wolfgang Dröge-Laser (Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Würzburg) für die Bereitstellung der Ausrüstung und der Ressourcen, die für diese Arbeit benötigt werden, und Wolfgang Dröge-Laser sowie Philipp Kreisz (beide Universität Würzburg) für das kritische Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Studie wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, DR273/15-1,2) gefördert.

Materials

Agar (Gelrite) Carl Roth Nr. 0039 all systems described require Gelrite
Arabidopsis thaliana wild-type NASC stock Col-0 (N1092)
Autoclave Systec VE-100
BlattFlaeche Datinf GmbH BlattFlaeche software to determine leaf areas
Brassica napus wild-type see Floerl et al., 2008 rapid-cycling rape genome ACaacc
Cefotaxime sodium Duchefa C0111
Chicanery flask 500 mL Duran Group / neoLab E-1090 Erlenmeyer flask with four baffles
Collection tubes 50 mL Sarstedt 62.547.254 114 x 28 mm
Czapek Dextrose Broth medium Duchefa C1714
Digital camera Nikon D3100 18-55 VR
Exsiccator (Desiccator ) Duran Group 200 DN, 5.8 L Seal with lid to hold chlorine gas
Fluorescence Microscope Leica Leica TCS SP5 II
HCl Carl Roth P074.3
KNO3 Carl Roth P021.1 ≥ 99 %
KOH Carl Roth 6751
Leukopor BSN medical GmbH 2454-00 AP non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m
MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) Carl Roth 4256.2 Pufferan ≥ 99 %
MgSO4 Carl Roth T888.1 Magnesiumsulfate-Heptahydrate
Murashige & Skoog medium (MS) Duchefa M0222 MS including vitamins
NaClO Carl Roth 9062.1
Percival growth chambers CLF Plant Climatics GmbH AR-66L2
Petri-dishes Sarstedt 82.1473.001 size ØxH: 92 × 16 mm
Plastic cups (500 mL, transparent) Pro-pac, salad boxx 5070 size: 108 × 81 × 102 mm
Pleated cellulose filter Hartenstein FF12 particle retention level 8–12 μm
poly klima growth chamber poly klima GmbH PK 520 WLED
Potato Dextrose Broth medium SIGMA Aldrich P6685 for microbiology
Pots Pöppelmann GmbH TO 7 D or TO 9,5 D Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm
PromMYB51::YFP see Poncini et al., 2017 MYB51 reporter line YFP (i.e. 3xmVenus with NLS)
Reaction tubes 2 mL Sarstedt 72.695.400 PCR Performance tested
Rotary (orbital) shaker Edmund Bühler SM 30 C control
Sand (bird sand) Pet Bistro, Müller Holding 786157
Soil Einheitserde spezial SP Pikier (SP ED 63 P)
Solanum lycopersicum wild-type see Chavarro-Carrero et al., 2021 Type: Moneymaker
Thoma cell counting chamber Marienfeld 642710 depth 0.020 mm; 0.0025 mm2
Ultrapure water (Milli-Q purified water) MERK IQ 7003/7005 water obtained after purification
Verticillium dahliae see Reusche et al., 2014 isolate JR2
Verticillium longisporum Zeise and von Tiedemann, 2002 strain Vl43

References

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Cite This Article
Marsell, A., Fröschel, C. Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms. J. Vis. Exp. (181), e63446, doi:10.3791/63446 (2022).

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