Um método conveniente de perfusão alimentado pela gravidade para análise histológica do sistema nervoso central do rato é apresentado. A detecção imunofluorescente de α-sinucleína fosfoilada é demonstrada em um modelo de camundongo da doença de Parkinson. Este trabalho também descreve de forma abrangente as etapas de perfusão transcárdia, dissecção, congelamento/incorporação de tecidos e etapas de secção congelada.
A análise histológica de amostras cerebrais e medulas isoladas de camundongos é prática comum para a avaliação da patologia neste sistema modelo. Para manter a morfologia desses tecidos delicados, é rotina administrar um fixador químico como o paraformaldeído via cannulação do coração em animais anestesiados (perfusão transcárdia). A perfusão transcárvia do coração do camundongo tem tradicionalmente se apoiado no uso de bombas peristálticas ou pressão de ar para fornecer soluções salinas e fixativas necessárias para este processo. Como uma alternativa de fácil acesso a esses métodos, este trabalho demonstra o uso de um método alimentado pela gravidade de entrega perfusada que utiliza materiais disponíveis na maioria das lojas de hardware.
Para validar este novo método de perfusão, este trabalho demonstra todas as etapas subsequentes necessárias para a detecção sensível de α-sinucleína fosforilada no cérebro e na medula espinhal. Estão incluídos nestas etapas a dissecção dos tecidos fixos do cérebro e da medula espinhal, congelamento/incorporação rápida e criosecção dos tecidos e coloração imunofluorescente. Como este método resulta na entrega do corpo inteiro do fixador, ele também pode ser usado para preparar outros tecidos não neuronais para análise histológica.
Caracterização histológica da patologia no sistema nervoso central do camundongo (SNC) é uma técnica de rotina usada em estudos de neurodegeneração. À medida que os tecidos neuronais se degradam rapidamente após a morte, é prática comum fornecer um fixador químico como paraformaldeído aos tecidos do SNC para preservar sua morfologia 1,2. A fixação química pode ser realizada através da perfusão do corpo inteiro com uma solução fixa ou através do isolamento dos tecidos e sua imersão em uma solução fixa (chamada de “fixação de queda”). A perfusão é o método preferido de entrega fixativa, pois a fixação de gotas pode não permitir a penetração rápida da solução fixativa em estruturas profundas de CNS 3,4,5. Além disso, como é difícil remover a medula espinhal não fixada da coluna vertebral, a entrega da solução fixa por perfusão permite a preservação in situ da anatomia microscópica e grosseira da medula espinhal e endurece o tecido para minimizar os danos durante a remoção.
A entrega das soluções tampão e fixação necessárias para fixação é comumente realizada usando bombas comercialmente disponíveis ou pressão de ar. A entrega de gravidade do perfusato pode servir como uma alternativa à entrega da bomba pelos seguintes motivos: (1) A entrega de bomba ou pressão de ar pode, em alguns casos, exigir que o usuário mantenha manualmente a pressão no sistema durante toda a perfusão. A entrega de gravidade do perfusato pode ser mantida sem intervenção do usuário. (2) Um aparelho de perfusato fornecido pela gravidade pode ser construído a baixo custo para o usuário, obtendo materiais disponíveis de fornecedores científicos padrão. Este trabalho descreve como construir um simples dispositivo de perfusão de gravidade usando garrafas de lavagem e tubos de vinil. Usando um modelo de camundongo da doença de Parkinson, este trabalho demonstra a eficácia deste sistema na perfusão dos tecidos cerebrais e medulas espinhais antes de seu isolamento para seção congelada. Este trabalho descreve de forma abrangente todas as etapas, técnicas e materiais necessários para dissecar o tecido fixo do animal, congelar/incorporar e crioseccionar rapidamente o tecido, e detectar a presença de α-sinucleína fosforilada no cérebro e na medula espinhal através de microscopia de imunofluorescência indireta.
Este trabalho descreve os passos críticos para a realização da perfusão transcárvia. Ao construir o aparelho de perfusão (seção de protocolo 1), é importante usar tubos flexíveis o suficiente para serem completamente ocluídos por um hemostat. Alguns tubos rígidos podem não ser suficientemente ocluídos por um hemostat e ainda podem permitir que pfa vaze na linha principal durante a perfusão inicial pbs. Ao preparar a solução de 4% pfa, é importante garantir que o pH seja fisiológico (7.4). Como a preparação da solução PFA envolve aquecê-lo a 65 °C, a solução deve ser resfriada até 25 °C antes de medir o pH, pois esta é a temperatura em que o pH é calibrado no medidor.
Ao fazer a incisão inicial no abdômen, deve-se tomar cuidado para evitar a laceração dos órgãos abdominais (seção 2 do protocolo). Ao dissecar superiormente em direção ao diafragma, é importante evitar a laceração do fígado, pois é comum o fígado ser aderente com a parede abdominal anterior. Para superar isso, o fígado é cuidadosamente e sem rodeios longe da parede anterior antes de continuar uma incisão em direção ao diafragma. Ao entrar na cavidade torácica através do diafragma, é importante evitar a laceração do coração, grandes vasos e o pulmão. Para evitar isso, a ponta da tesoura é mantida superficialmente e em um ângulo agudo com a caixa torácica.
A dissecção inicial para expor o coração leva aproximadamente 2 minutos da incisão inicial. Espera-se que durante este tempo, algum ar tenha entrado na ponta da agulha borboleta. A introdução deste ar na circulação do mouse produzirá perfusão de má qualidade. Portanto, é fundamental que a linha principal seja aberta e o PBS seja lavado pela agulha imediatamente antes da cannulação do coração para remover bolhas de ar. Idealmente, o coração é cânulado enquanto uma pequena gota de PBS flui através da ponta da agulha para garantir a completa ausência de ar ao perfurar o LV.
Quando a agulha entra na LV, não deve ir tão fundo a respeito de introduzir a ponta da agulha no ventrículo direito (RV). A colocação da agulha no RV ou além da válvula mitral resultará em “inflação” imediata dos pulmões quando a perfusão for iniciada. Isto é indesejável, e a agulha deve ser retirada ligeiramente para garantir a colocação da LV. Se a agulha for colocada corretamente, os pulmões permanecerão planos durante toda a perfusão. Quando a perfusão é iniciada, às vezes é observado que um líquido claro está emergindo da boca aberta do animal. Isso geralmente é devido a uma pressão de perfusão que é muito alta ou devido ao deslocamento da agulha dentro do coração. Os autores especulam que pressões elevadas de perfusão resultam em extravasão do perfusato do leito capilar arteriolar e fluxo retrógrado de PBS através da árvore brônquica para o esôfago e cavidade oral.
A pressão de perfusão deve ser reduzida diminuindo o nível de PBS na garrafa PBS ou baixando a altura da garrafa PBS. Alternativamente, se a agulha for colocada muito profundamente no ventrículo esquerdo, ela pode viajar através da válvula mitral e entregar perfusado ao átrio esquerdo. Isso pode resultar em fluxo retrógrado através das veias pulmonares e extravasação de perfusato nas artérias, como descrito acima. O despejo minucioso de sangue do sistema circulatório com PBS é especialmente importante para evitar a ligação cruzada induzida por fixação de componentes sanguíneos, resultando em oclusão do vaso após a posterior perfusão fixa. A liberação é efetivamente avaliada por uma mudança de cor do fígado e do fluxo de PBS a partir de uma incisão na base da cauda ventral. A liberação sanguínea é geralmente completa por 3 minutos de perfusão com PBS; no entanto, se os sinais visuais de liberação ocorrerem em tempos mais curtos, então fixação é introduzida antes de 3 min. Tempos de liberação mais longos não são recomendados, pois a perfusão fixação retardada leva a artefatos na estrutura fina cns1.
Quando o PFA está sendo administrado, é importante monitorar o nível da solução PFA na garrafa PFA. Encha a garrafa PFA se o nível de PFA cair para menos de 4 cm acima da boca da garrafa PFA. Após a conclusão da perfusão, o aparelho de perfusão deve ser completamente enxaguado com água destilada. Isso é importante, pois o PFA residual na linha principal contaminará a perfusão inicial do PBS com PFA e resultará em má qualidade da perfusão. Finalmente, agulhas de borboleta de 25 G são geralmente recomendadas para ratos adultos de tamanho médio na faixa de 20-30 g. No entanto, camundongos maiores ou menores podem exigir agulhas de bitola ligeiramente maiores ou menores, além do ajuste das garrafas fixas para fornecer taxas de fluxo ideais.
Para dissecção cns e incorporação de OCT (seção de protocolo 3), é comum que os tecidos da medula espinhal não afundem completamente em 30% de sacarose. Esses tecidos são, portanto, deixados em sacarose por 2 dias e depois incorporados em OUTUBRO, independentemente de afundarem ou não. Ao congelar tecidos em OUTUBRO, é possível que certos tecidos possam rachar quando colocados em 2-metilbutano resfriado. Isso é mais comum com o cérebro e geralmente ocorre quando muito OCT é colocado no tecido. Para evitar isso, coloque apenas o suficiente de OCT para cobrir as superfícies do tecido antes do congelamento imediato. Em alguns protocolos, rachaduras são menos comuns apesar da imersão completa em OUTUBRO. Isso geralmente é devido a um método de congelamento mais lento, como ao usar 2-metilbutano resfriado com gelo seco ou colocar o criomold em um bloco de gelo seco diretamente. O 2-metilbutano refrigerado a nitrogênio líquido é preferido neste trabalho, pois a taxa de congelamento é substancialmente mais rápida e pode preservar melhor a morfologia tecidual do que métodos de congelamento mais lentos.
Ao crioseccionar o tecido (seção de protocolo 4), é importante evitar múltiplos ciclos de congelamento. Portanto, é ideal cortar todas as seções de um único bloco de OCT para obter uma região cerebral específica para análise em vez de descongelar e recongelar áreas selecionadas. Se isso não for viável, depois de obter algumas seções, os usuários podem recongelar e armazenar os blocos OCT no congelador profundo de -80 °C mais 1-2 vezes para uso futuro.
Os principais benefícios deste método em relação à entrega mais tradicional de bomba ou pressão de ar de perfusato são os seguintes: (1) baixo custo e acessibilidade do aparelho de perfusão. (2) Os usuários não precisam manter manualmente a pressão no aparelho de perfusão durante toda a perfusão. (3) Pressão de perfusão menor e mais consistente do que outras alternativas de baixo custo para a perfusão, como a entrega de seringas. Usando a equação de Bernoulli, calcula-se que o aparelho de perfusão alimentado pela gravidade construído aqui manterá uma pressão de perfusão de aproximadamente 73 mm Hg quando as garrafas de perfusato forem colocadas a 1 m de elevação em relação à agulha. Dado que isso está significativamente abaixo da pressão arterial sistólica desses animais, esta pressão de perfusão é provavelmente suficientemente baixa para evitar a ruptura vascular12.
Até agora, os autores usaram com sucesso este sistema de perfusão para detectar a presença de α-sinucleína fosforilalada em um modelo de camundongos da doença de Parkinson. Durante este período, não foram encontradas limitações significativas com este método de perfusão que não estejam presentes com um método de entrega de perfusão da bomba. A maior limitação desta técnica é a natureza demorada da perfusão versus fixação de queda. Esta técnica é preferível a queda da fixação, pois a perfusão resulta na penetração mais profunda da fixação às estruturas do CNS. Uma segunda limitação desta técnica é que ela requer alguma habilidade cirúrgica para realizar, pois o coração deve ser cânulado rapidamente após a entrada na cavidade torácica. No entanto, com a experiência, usuários treinados podem rotineiramente canular o coração dentro de 1 minuto da incisão inicial no abdômen.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Xiaowen Wang, Liam Coyne e Jason Grullon por sua ajuda no desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH AG061204 e AG063499.
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