마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

이 프로토콜에 제시된 데이터 및 실험 단계는 C57BL/6J 마우스를 사용하여 생성되었다. 동물과 관련된 모든 방법은 뉴욕 주립 대학 Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 1. 관류장치 및 해부플랫폼 구축 그림 1에서 볼 수 있듯이, 두 개의 500mL 세척병에서 날카로운 면도날로 이 플러시를 스크류 온 캡의 안쪽으로 절단하여 내부 빨대를 다듬습니다. 각 버퍼 병의 바닥에 4cm x 4cm 사각형 구멍을 자릅니다. 구부러진 스테인레스 스틸 미세 주걱을 통과 할 수 있도록 각 병의 바닥에 작은 구멍을 자릅니다. 미세 주걱에 “S”모양의 굴곡을 만들어 버퍼 병을 매달기위한 후크로 사용할 수 있도록하십시오. 구부러진 미세 주걱을 완충 병의 적절한 구멍에 넣으십시오. 25cm 길이의 튜브 두 개를 자르고 외부 병 짚 배출구와 단단히 연결하십시오. 이 튜브의 끝을 Y 커넥터와 함께 결합하십시오. 2m의 튜빙을 자르고 Y 커넥터의 자유 끝에 결합하십시오. 1 mL 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기를 주사기 팁으로부터 약 6 cm 떨어진 곳에 절단하였다. 먼저 면도날로 플라스틱을 채점한 다음 주사기 플라스틱을 날카롭게 스냅하여 주사기를 자릅니다. 주사기의 절단면을 플라스틱 튜브의 자유 끝에 삽입하십시오. 밀봉을 단단히 밀봉할 수 있도록 충분한 깊이로 삽입하십시오.참고: 관류 장치 내의 모든 연결부는 누출을 피하기 위해 충분히 단단해야 합니다. 느슨한 연결의 경우, 필요한 경우 단단한 씰을 보장하기 위해 작은 스테인레스 스틸 호스 클램프를 원하는 대로 접합부에 배치하고 조일 수 있습니다. 하나의 버퍼 병을 PFA 로, 한 병을 PBS (버퍼)로 라벨링하십시오. 병 개구부에서 길이의 약 1/3분 의 1을 측정하고이 시점에서 병 둘레 주위에 선을 그려 향수 용액의 적절한 충전 수준을 나타냅니다. 곧게 펴고 튜브의 둘레 주위에 들어갈 수 있는 큰 종이 클립에 루프를 만듭니다. 이 루프를 주사기에 바로 근접한 튜브 주위에 놓습니다. 적절한 크기의 스티로폼 블록을 유리 트레이에 넣으십시오. 종이 클립의 끝을 스티로폼 블록에 넣어 튜브를 부착합니다. 종이 타월을 사용하여 유리 트레이의 앞쪽 끝을 약 2cm 정도 올립니다.참고: 이렇게 하면 마우스를 Trendelenburg 위치(뒤로 기울기)의 약 20°에 배치하여 해부 중 다이어프램을 보다 쉽게 시각화하고 관류 중 유체의 배수를 촉진합니다. 도 1: 조립된 관류 장치를 묘사한 도면. 약어: PBS = 포스페이트-완충 식염수; PFA = 파라포름알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 파라포름알데히드(PFA) 용액의 제조 참고: PFA 용액은 관류 당일에 신선하게 준비해야 하며, 관류가 끝나면 숙련된 인력이 폐기하기 전에 지정된 폐기물 용기에 버려야 합니다. 이 프로토콜은 약 4마리의 마우스를 퍼퓨즈하기에 충분한 4% PFA 용액 1L를 만든다. PFA는 독성이 강하므로 분말 또는 액체 형태로 흡입이나 직접적인 피부 접촉을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 따라서 대부분의 준비 단계는 장갑, 프로텍토브 고글 및 흄 후드 아래의 실험실 코트를 착용하는 동안 수행됩니다. 증류수를 사용하여 1L 비커를 헹구고 약 800mL의 18mΩ 분자 생물학 등급H2O로 채웁니다. H2O의 비이커를 마이크로파에서 3분 동안 또는 수온이 65°C에 도달할 때까지 가열한다. 흄 후드에 보관 된 가열 / 교반 플레이트 위에 놓습니다. 교반 막대를 증류수로 헹구고 뜨거운 물에 넣으십시오. 교반기를 시작하고 핫 플레이트를 중간 열까지 돌립니다. 수온이 70 °C를 초과하지 않도록하십시오. 수술용 마스크, 장갑, 보호 고글 및 실험실 코트를 착용하고 PFA 분말 40g을 측정하십시오. 이 분말을 가열 된 물에 붓습니다. 전사 피펫을 사용하여 용액에 5M NaOH 몇 방울을 첨가하십시오. PFA 분말이 완전히 용해되도록 하십시오. 몇 분 후에 분말이 완전히 용해되지 않으면 필요에 따라 5M NaOH 방울을 첨가하십시오. 거의 모든 PFA가 용해되면 (약간 혼탁하게 보일 것입니다), 교반 / 가열을 중단하고 즉시 10x 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 mL를 첨가하십시오. 마지막으로, 18 mΩ 분자 생물학 등급H2O. 비커를 플라스틱 랩으로 덮고 용액이 실온 (약 45 분)에 도달 할 때까지 -20 °C 냉동고에 놓습니다. 적절한 표준을 사용하여 pH 측정기를 교정하십시오. 비커가 교반 플레이트 상에 있는 동안, 용액의 pH를 측정하고 pH가 7.4에 도달할 때까지 HCl을 첨가한다. 필요한 경우 5 M NaOH를 첨가하여 pH가 너무 낮 으면 pH를 증가시킵니다. 진공 플라스크를 진공에 연결하고 플라스크에 여과지가 있는 깨끗한 세라믹 Büchner 깔때기를 놓습니다. 진공을 켜고 4% PFA 용액으로 채워진 전사 피펫을 사용하여 여과지를 적시다. 모든 용액이 여과될 때까지 4% PFA 용액을 여과지에 천천히 붓는다. 여과 된 용액을 깨끗하고 빛 보호 된 용기로 옮기고 사용 전까지 4 °C에서 보관하십시오 (24 시간 이상 보관하지 마십시오). 3. 심질 “펌프 프리”관류 흄 후드에 스티로폼 해부 블록을 유리 트레이에 놓습니다. 해부 블록에 수술 중 마우스를 제지하기위한 5-6 개의 짧은 바늘과 관류 튜브를지지하기위한 2 개의 긴 바늘이 있는지 확인하십시오. 관류 장치를 증류수를 사용하여 헹구십시오. 관류 장치를 매달기 전에 모든 물이 배수되도록 허용하십시오. 관류 병을 관류 된 동물 (20-30g 마우스의 경우) 1m 위에 걸어 놓습니다. 18 mΩ 분자 생물학 등급H2O로 희석된 10x PBS를 사용하여 1x PBS의 비멸균 용액을 제조하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 지혈제를 이용하여 관류 장치의 메인 라인을 클램프한다. PFA 라인을 다른 지혈제로 고정하십시오.참고 : 흐름을 완전히 방지하기 위해 여러 지혈구가있는 폐색이 라인 당 필요할 수 있습니다. 버퍼 용기를 실온에서 1x PBS로 채운다. 관류 장치의 주사기 단부를 비이커에 넣어 폐기물 버퍼를 모으고 본선을 폐색시키는 지혈제를 제거한다(그림 2, 왼쪽). PBS가 튜브의 벽을 격렬하게 두드리면서 갇힌 공기를 제거하면서 라인을 통해 흐르도록하십시오. 버퍼와 메인 라인에서 모든 공기가 제거되면 메인 라인에 지혈제를 배치하여 흐름을 막으십시오. PFA 라인에서 지혈제를 제거하고 PBS가 PFA 라인의 모든 기포를 두드리면서 PFA 병까지 역행 방식으로 흐르도록 합니다(그림 2, 중간). PBS가 병의 개구부 바로 위에서 보일 때까지 PBS를 PFA 라인 내로 계속 허용한다. PFA 병으로의 유동을 막기 위해 지혈제로 PFA 라인을 폐색시킨다. 나비 주입 바늘을 관류 주사기에 연결하고 PBS를 플러시 라인을 통해 (지혈제 메인 라인을 개방함으로써) 관류 주사기로부터 기포를 제거한다. 메인 라인 지혈제를 닫습니다. PBS 병이 이제 PBS로 가득 찬 약 1/3번째 인지 확인하십시오. 필요한 경우, 메인 라인을 통해 PBS를 플러시하거나 전체 용량의 1/3이 될 때까지 버퍼 병에 더 많은 PBS를 채웁니다. PBS, PFA 및 메인 라인에서 모든 기포가 제거되면 PFA 병을 실온에서 4% PFA 용액으로 채우고 병의 검은색 표시(약 1/3번째 전체)까지 채웁니다(그림 2, 오른쪽). 도 2: 관류 수술을 위한 관류 장치의 제조. 먼저 PFA 라인 지혈제를 닫고 PBS 라인과 메인 라인의 지혈제를 엽니 다. PBS를 채우고 PBS 라인 및 메인 라인에서 거품을 제거하십시오. 다음으로, PFA 라인에서 지혈제를 열고 메인 라인의 지혈제를 닫음으로써 PBS로 PFA 라인을 채 웁니다. PFA 라인에서 기포를 제거합니다. 마지막으로, PBS가 PFA 병의 개구부에 도달하면 PFA 라인의 지혈제를 닫으십시오. PFA 병의 1/3번째 PFA를 채 웁니다. PBS 병의 PBS 수준이 1/3번째 가득 찼 는지 확인하고 필요한 경우 메인 라인 지혈제를 열어 PBS로 채우거나 PBS를 배출하십시오. 약어: PBS = 포스페이트-완충 식염수; PFA = 파라포름알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 다음 도구를 물로 청소하고 70 % 에탄올로 청소하여 생존 할 수 있도록 준비하십시오 : 큰 가위, 미세 해부 가위, 피부 포셉, 미세한 배상 곡선 포셉. 먼지가없는 물티슈를 50 mL 원뿔형 튜브에 넣어 마취를 준비하십시오. 흄 후드에서 먼지가없는 물티슈를 이소플루란으로 완전히 담그고 열린 튜브를 500mL 비이커에 거꾸로 놓습니다. 비이커의 바닥에 액체 이소플루란이 존재하지 않는지 확인하고 마우스를 비이커에 넣기 전에 액체 이소플루란을 버리십시오. 마우스를 비이커에 놓고 플라스틱 랩을 개구부 위에 올려 놓고 마취를 시작하십시오. 마우스가 호흡을 멈출 때까지 마취를 시행하십시오 (약 1 분 및 30 초). 호흡이 멈췄을 때, 즉시 비이커에서 마우스를 제거하고 50 mL 원뿔형 튜브의 캡을 교체하십시오. 마우스가 발가락 핀치 반사를 사용하여 충분히 마취되었는지 확인하십시오. 동물이 충분히 마취되지 않은 경우, 단계 3.15에 기재된 바와 같이 이소플루란을 추가로 투여한다. 빠르게 작동하여 마우스를 스티로폼 블록 위에 놓고 네 개의 짧은 바늘 (예 : 22G 주사기 바늘)을 사용하여 발을 바깥쪽으로 고정하십시오. 피부 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 큰 가위를 사용하여 복벽을 자르십시오. 복부 장기가 절단되지 않도록하십시오! 복부 절단을 간쪽으로 우월하게 계속하십시오. 전방 복벽에서 간을 분리하고 횡격막 쪽으로 우월하게 초기 절개를 계속하십시오. 이 절개를 횡격막보다 약 1cm 열등하게 멈추십시오. 간이 잘리지 않도록주의하십시오! 다이어프램의 오른쪽과 왼쪽을 향해 횡방향으로 초기 절개를 계속하여 “Y”모양의 절개를 만듭니다 (그림 3A). 절개가 횡격막에 도달하면 미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막에 구멍을 뚫고 동물의 오른쪽에있는 갈비뼈를 자르십시오. 갈비뼈를 오른쪽 겨드랑이의 절반 정도를 자릅니다. 횡격막의 왼쪽을 통해 거의 왼쪽 겨드랑이까지 비슷하지만 더 긴 절개를하십시오. 가슴 벽을 반사하고 스티로폼 블록에 고정하십시오. 필요한 경우 심장 주위의 지방을 해부하여 좌심실을 노출시킵니다. 우심실과 비교할 때 상대적으로 밝은 색을 기준으로 좌심실을 확인하십시오. 좌심실을 확인한 후 미세한 곡선 포셉으로 가벼운 압력을 사용하여 심장을 일정하게 유지하십시오. PBS가 바늘을 통해 흐를 수 있도록 메인 라인 지혈제를 엽니 다. 즉시 좌심실을 관통하고 바늘이 심실에 0.5cm 이상 삽입되지 않도록하십시오. 필요한 경우 바늘을 약간 철회하십시오.참고 : 좌심실에 바늘을 정확하게 배치하는 것은 바늘 튜브로 혈액의 역행 흐름으로 표시됩니다. 바늘이 심실에 너무 깊이 삽입되지 않도록하는 것이 중요합니다. 이것은 폐정맥을 통한 역행 흐름을 초래하거나 심실 중격을 관통 할 수 있습니다. 두 개의 큰 18G 바늘을 사용하여 스티로폼으로 만든 X 에 나비 튜브를 놓습니다.참고 : 이것은 관류 중에 심장 내에서 나비 바늘의 움직임을 피하기 때문에 중요합니다. 열등한 베나 카바가 간을 빠져 나올 때 확인하고 미세한 해부 가위를 사용하여 횡단합니다 (그림 3B). 또는 가위로 오른쪽 아트리움을 엽니 다. PBS 관류가 시작될 수 있도록 메인 라인을 즉시 엽니다(그림 3C). PBS가 스티로폼 블록에서 배수되어 아래의 유리 트레이로 배출되는지 확인하십시오. 이런 일이 발생하지 않으면 트레이 또는 Styrofoak 블록의 각도를 재조정하여 유리 트레이로 유체가 배출되도록 하십시오. 열등한 정맥 카바에서 유출되는 액체가 무혈이 될 때까지 PBS 관류를 계속한다 (대략 3 분).참고 : 심장에 바늘을 올바르게 배치하면 간에서 혈액이 시각적으로 제거되어 빨간색에서 짚 색으로 변합니다. 이것이 발생하지 않으면 주입 바늘을 좌심실 내에 재배치하여 해결할 수 있습니다. 관류의 질을 평가하기 위해 복부 꼬리 기초에서 작은 절개를 할 수 있습니다. 적절한 관류는 꼬리 염기 절개로부터 흐르는 명확한 PBS를 초래할 것이다. 신속하게 작업하고, 지혈제로 PBS 라인을 폐색하고 PFA 라인을 엽니 다. 꼬리가 말리기 시작할 때까지 PFA가 몇 분 동안 관류되도록 허용하십시오. 꼬리가 말리기 시작하면 50 분 타이머를 시작하십시오. PFA 관류 5 분 후에 꼬리가 말리지 않으면 PFA 관류를위한 50 분 타이머를 시작하십시오. 관류 전반에 걸쳐 병의 PFA 수준을 지속적으로 모니터링하여 레벨이 너무 낮게 떨어지지 않도록하십시오. 레벨이 병 뚜껑 위로 2cm 아래로 떨어지면 병에 PFA를 더 채 웁니다. 그림 3: 심질 관류를 묘사한 다이어그램. (A) 복벽이 먼저 절단되고, 그 다음에 “Y”를 형성하는 겨드랑이를 향해 두 개의 측면으로 향하는 절개가 뒤따른다. (B) 흉강에 들어가서 심장을 노출시킨 후, 바늘을 좌심실로 전달한다. 다음으로, IVC 또는 우심방이 횡단되어 향수가 신체를 통해 순환 된 후에 향수를 배출 할 수 있습니다. IVC는 다이어프램보다 우월하게 절단됩니다. (C) 향수의 투여 절차. 약어 = IVC = 열등한 베나 카바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 50 분이 경과 한 후, 지혈제로 메인 라인을 폐색하고 좌심실에서 바늘을 뽑으십시오.참고: 전체 마우스는 이 시점에서 뻣뻣하고, 이제 4°C에서 하룻밤 사이에 4% PFA의 라벨링된 용기에 넣을 수 있다. 이 단계에서는 CNS 조직을 해부하고 하룻밤 사이에 개별적으로 고정시킬 수 있습니다. 이 작업에서는 4 °C에서 고정과 배치 사이의 간격이 단축되므로 전체 마우스를 고정에 배치합니다. 이것은 또한 밤새 고정이 완료되기 전에 동물을 미리 해부하는 경우 발생할 수있는 신경 조직의 기계적 왜곡을 피할 수 있습니다. 4. CNS 해부 물로 씻은 다음 70 % 에탄올로 해부를 위해 다음 도구를 준비하십시오 : 가위, 피부 포셉, 곡선 결합 포셉, 곡선 미세 포셉, 직선 미세 포셉, 미세 가위. 마우스 당 네 개의 튜브에 다음과 같이 라벨을 붙이고 멸균 20 % 수크로오스로 채 웁니다 : 마우스 ID, 뇌 1, 마우스 ID, 뇌 2, 마우스 ID, 요추, 마우스 ID, 자궁 경부. PFA 용액에서 마우스를 제거하고 종이 타월로 블롯하여 과량의 PFA를 제거하십시오. 큰 가위를 사용하여 목을 자르면 마우스 머리를 제거하십시오. 몸체를 PFA 용액에 넣으십시오. 두개골에서 뇌를 해부하기 위해 머리를 유지하십시오. 뇌를 해부하려면 두개골 피부를 앞으로 반사하여 두개골 전체를 노출시킵니다 (그림 4A). 두개골에 들어가기 위해 미세한 해부 가위를 사용하여 청각 운하로 얕게 자르십시오. 두개골이 두 청각 운하 사이의 끝까지 절단 될 때까지 횡단 부비동을 따라이 절단을 계속하십시오. 세로 균열을 따라 두개골의 가장 로스트랄 부분 (대략 눈 사이)까지 이전 컷에 수직으로 절단하십시오. 페네스티드 곡선 포셉을 사용하여 두개골을 옆으로 반사하여 전뇌를 노출시킵니다. 후각 전구를 포함한 전뇌 전체가 노출 될 때까지 두개골을 계속 제거하십시오. 후두부 뼈를 통해 절단하고 천천히 포라멘 매그넘쪽으로 잘라 두개골의 꼬리 영역을 해부하기 시작하십시오. 두개골의 두 조각을 옆으로 반사하여 소뇌와 뇌간을 caudally 노출시킵니다 (그림 4B). 초미세 곡선 포셉을 사용하여 후각 전구를 전방 두개골에서 분리하고 후각 전구에서 시작하여 두개골 기저부에서 뇌를 벗겨 내기 시작하십시오. 뇌가 두개골 기저부에서 벗겨 지므로 초미세 포셉을 사용하여 두개골 신경을 자르고 뇌를 제거하십시오. 손상되지 않은 뇌 전체가 제거될 때까지 두개골 기저부에서 뇌를 계속 떼어냅니다(그림 4C,D). 세로 균열을 따라 뇌를 반으로 잘라 오른쪽과 왼쪽 반구를 서로 분리합니다(그림 4E,F). 뇌 1 튜브에 하나의 반구를 놓고 뇌 2 튜브에 두 번째 반구를 놓습니다. 뇌 반구가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤 동안). 그림 4: 고정된 뇌의 제거 . (A) 두개골 꼭대기. (B) 두개골 내에 노출된 뇌. (C) 고립 된 뇌 (등쪽 측면). (D) 고립 된 뇌 (복부 측면). (E) 좌반구 (측면 측면). (F) 좌반구 (내측 양상). 스케일 막대 = 1cm(E 및 F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 척수를 해부하려면 PFA에서 마우스 몸체를 제거하고 건조시킵니다. 마우스를 경향이있는 스티로폼 해부 블록에 놓고 네 개의 바늘을 사용하여 발을 블록에 고정하십시오. 마우스의 중간 선을 목에서 꼬리까지 아래로 잘라 전체 뒷면을 노출시켜 해부를 시작하십시오. 뒤쪽에 근육과 근막을 반사하여 척추 기둥의 후부 부분을 노출시킵니다. 대부분의 두개골 척추에서 시작하여 미세한 해부 가위를 사용하여 척수를 피하면서 라미나를 절단하십시오 (그림 5A). 초미세 곡선 포셉을 라미나 아래에 놓고 위쪽으로 당겨 척추를 골절시켜 척수를 노출시킵니다(그림 5B). 구부러진 포셉을 사용하여 골절 된 척추를 반사하고 척수의 가장 측면 영역을 노출시킵니다. 초미세 곡선 포셉을 라미나 아래에 놓고 척추를 파쇄하여 다음 척추에 대해이 과정을 계속하십시오. 전체 경추와 흉추가 노출될 때까지 척추 골절을 계속하십시오(그림 5C). 요추 척수가 끝날 때까지 척수를 계속 노출시킵니다(그림 5D). 날카로운 면도날을 사용하여 흉부 척수를 끝까지 자릅니다. 초미세 곡선 포셉을 사용하여 척추 신경을 척추 앞쪽에서 척수로 옆으로 횡단하여 척추 기둥에서 천천히 경추 척수를 분리합니다. 척추가 없을 때까지 자궁경부 척수를 계속 해부합니다(그림 5E). 자궁 경부 – 중흉부 척수를 자궁 경부라고 표시된 튜브에 넣으십시오. 자궁경부 척수가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤 사이). 4.22 단계부터 4.25 단계까지 완추 척추를 계속 골절시킵니다. cauda equina가 노출되면 날카로운 면도날을 사용하여 요추 척수 아래 1cm 아래의 척수를 자릅니다 (그림 5F). 4.26-4.27 단계에 설명 된대로 척추에서 요추 척수를 해부하십시오. 요추 중간 cauda equina 척수를 요추라고 표시된 튜브에 넣으십시오. 요추 척수가 가라앉을 때까지 이 튜브를 4°C에 보관하십시오(대략 하룻밤). 모든 조직이 20 % 자당에 가라 앉았을 때, 가라 앉을 때까지 또는 3 일 동안 30 % 자당의 라벨이 붙은 튜브로 옮깁니다.참고 : 척추 조직은 종종 30 % 자당에서 가라 앉지 않습니다. 그림 5 : 고정 척수 세그먼트 제거. (A) 자궁 경부 척추의 라미나로 초기 절단. (B) 개별 척추를 골절시키기 위해 구부러진 포셉의 배치. (C) 노출된 경추. (D) 노출된 자궁경부, 흉추, 요추. (E) 척추 신경을 절단 한 후 경추의 제거. (F) 성골 척추 절단. (G) 고립된 자궁경추. (H) 고립 된 요추. 스케일 막대 = 1cm(G 및 H). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 5. OCT 임베딩 및 조직 저장 각 마우스에 대해 네 개의 직사각형 모양의 냉동 몰드에 라벨을 붙입니다 : 마우스 ID, 오른쪽 반구, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 좌반구, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 자궁 경부, 임베딩 날짜; 마우스 ID, 요추, 포함 날짜. 스티로폼 용기를 설치하고 용기 위에 금속 컵을 걸어 놓습니다. 스티로폼 용기를 액체 질소의 절반 정도에 채 웁니다. 금속 컵을 신선한 2- 메틸 부탄으로 대략 반쯤 채 웁니다.참고 : 2- 메틸 부탄은 독성이 강하고 휘발성이 높으며 가연성입니다. 흄 후드에서 후속 단계를 수행하고 연소원에서 멀리 떨어져서 흡입을 피하기 위해주의를 기울여야합니다. 금속 컵을 액체 질소로 천천히 내리고 액체 질소가 금속 컵에 튀지 않도록하십시오. 2-메틸부탄이 얼기 시작하도록 허용하십시오. 2-메틸부탄이 얼고 있는 동안, 30% 수크로오스 용액에서 원하는 조직을 꺼내어 먼지가 없는 닦아내기로 닦아냅니다. 조직을 로스트랄 영역이 주형의 상단(라벨이 부착되지 않은) 부분을 향하도록 하는 cryomold에 놓습니다. 최적의 절단 온도 임베딩 매질(OCT)을 냉동 몰드 내의 조직 위에 드물게 붓고, 조직을 완전히 덮을 수 있을 정도만 사용한다. 과도한 OCT는 균열을 일으킬 수 있으므로 사용하지 마십시오. OCT에서 거품을 제거합니다. 냉동 2-메틸부탄이 금속 컵의 내부 표면을 완전히 덮었을 때, cryomold를 12 초 동안 위에 놓인 액상 2-메틸 부탄에 완전히 담그십시오. 12 초 후, cryomold를 라벨이 붙은 알루미늄 호일 사각형에 배수하고 전체 냉동 몰드를 감싼다. 즉시 포장 된 cryomold를 드라이 아이스에 놓고 해동을 피하십시오. 냉동 OCT/cryomold가 항상 드라이 아이스로 덮여 있는지 확인하십시오. 모든 조직에 대해 5.6-5.8단계를 반복합니다. 한 마리의 마우스용 티슈를 밀봉된 작은 비닐 봉지에 넣은 다음 냉동 안전 밀봉된 용기에 넣습니다. 이 용기를 절편이 절단될 때까지 -80°C 깊은 냉동고에 보관하십시오. 6. 냉동 절제술 냉동 절제하기 전에 냉동 챔버 온도와 시편 헤드가 적절한 설정으로 설정되어 있는지 확인하십시오.참고: -20°C의 챔버 온도, -20°C의 시편 헤드 온도 및 30μm의 단면 두께가 뇌 단면을 절단하는 데 사용됩니다. 척수 절편을 절단하기 위해, -23°C의 챔버 온도, -30°C의 시편 헤드 온도, 및 30 μm의 단면 두께가 사용된다. cryostat 설정 (특히 시편 헤드 온도)은 조직 품질 문제를 해결하기 위해 단면화 중에 조정되어야한다는 점에 유의해야합니다. 일반적으로 시편 헤드 온도는 조직 번짐에 대한 교정을 위해 낮아집니다. 반대로, 시편 헤드 온도는 과도한 조직 컬링을 교정하기 위해 증가합니다. -80°C 냉동고에서 원하는 OCT 블록을 제거하고 포장되지 않은 냉동 몰드/OCT 블록을 냉동 챔버에 놓습니다. OCT 블록이 30분 동안 챔버 온도에 적응하도록 허용하십시오. 척을 70% 에탄올로 닦고 먼지가 없는 물티슈로 닦아냅니다. 청소 된 척을 냉동 챔버에 놓고 척에 동전 크기의 OCT 원을 만드십시오. OCT가 얼어 붙도록 하십시오 (약 1-2 분). OCT가 얼어 붙었을 때, 완두콩 크기의 신선한 OCT 점을 척에 놓고 즉시 조직 OCT 블록을 척에 놓습니다. OCT가 완전히 얼기 전에 조직이 척에 완벽하게 수직인지 확인하십시오.참고 : 일반적으로 뇌의 가장 로스트랄 영역은 척쪽으로 배치되어 단면화가 꼬리 끝에서 시작됩니다. 척수의 경우, 일반적으로 가장 인과적 인 부위가 척에 배치되어 단면화가 로스트랄 끝에서 시작됩니다. OCT가 경화되었을 때, OCT 블록의 베이스 주위에 더 많은 OCT를 배치하여 단면화 동안 구조적 지지대 역할을 한다. 이 지지대가 약간 경화되면 척을 시편 헤드에 놓고 OCT 블록이 시편 헤드의 온도에 30분 동안 도달하도록 합니다. 마이크로톰 블레이드를 블레이드 홀더에 넣고 안티롤 플레이트를 청소하십시오. 안티롤 플레이트 거리를 조정하여 단면화 중에 조직이 플레이트 바로 아래를 통과하도록 합니다. 안티롤 플레이트의 올바른 위치에 대한 자세한 내용은 cryostat 설명서를 참조하십시오. OCT 블록이 시편 헤드 온도에 적응한 후, 조직에 도달할 때까지 OCT 블록을 트리밍하기 시작하십시오. 조직이 보이면 트리밍 에서 단면화 로 전환하고 30μm 절편을 절단하기 시작합니다. 안티롤 플레이트를 옆으로 옮기고 현미경 슬라이드를 사용하여 섹션을 집어 들으십시오. 절편의 해부학적 위치에 만족하거나 모든 조직이 절단될 때까지 절편을 계속 절단하고 수집한다. 슬라이드를 실온에서 1-3 일 동안 건조시킵니다. 건조 후 슬라이드를 슬라이드 박스에 넣고 이 상자를 밀봉된 비닐 봉지에 넣습니다. 슬라이드를 -80°C 깊은 냉동고에 배치하기 전에 마우스 ID 및 조직 정보로 백에 라벨링한다. 7. 면역형광염색 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 해동하십시오. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다. 블로킹 완충액(1x PBS 중 2% BSA + 0.3% 트리톤-X-100)을 준비한다. 슬라이드 당 약 1 mL를 사용하십시오. 바닥에 물을 추가하여 가습 챔버를 만듭니다. 슬라이드를 수평으로 위로 향하게 눕히고 건조되지 않도록 합니다. 블로킹 버퍼 1 mL를 각 슬라이드에 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다. 일차 항체를 항체 완충액 (1x PBS 중 0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100)으로 희석하여 일차 항체 용액을 제조하였다.주: 인산화된 α-시누클레인 항체의 경우, 1:500의 희석 계수가 사용되었다. 슬라이드 당 200-300 μL의 일차 항체 용액을 첨가하십시오. 항체를 분산시키기 위해 커버슬립으로 표지하고 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 커버슬립이 떨어지도록 1x PBS로 채워진 수직 코플린 병에 놓습니다. 각 슬라이드에 대해 개별적으로 이 작업을 수행하고 커버슬립을 제거할 때 조직 부분이 방해받지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다.참고 : 형광단의 광표백을 피하기 위해 모든 후속 단계를 수행 한 상태에서 수행해야합니다! 이차 항체를 항체 완충액에 희석하여 이차 항체 용액을 준비한다.참고: 인산화된 α-시누클레인의 검출을 위해, 항체 완충액 중 1:500의 희석 인자를 갖는 Alexa 488에 접합된 항토끼 이차 접합물(1x PBS 중 0.7% BSA + 0.3% Triton-X-100)을 사용하였다. 슬라이드를 가습 챔버에 수평으로 놓고 슬라이드 당 200-300 μL의 이차 항체 용액을 첨가하십시오. 항체를 분산시키기 위해 커버슬립으로 덮는다. 실온에서 적어도 2시간 동안 인큐베이션한다. 가습 챔버에서 슬라이드를 제거하고 커버슬립이 떨어지도록 1x PBS로 채워진 수직 코플린 병에 놓습니다. 각 슬라이드에 대해 개별적으로 이 작업을 수행하고 커버슬립을 제거할 때 조직 부분이 방해받지 않도록 주의하십시오. 슬라이드를 수평 슬라이드 병에 넣고 절편을 PBS로 3회 세척하고 진탕기 상에서 실온에서 각각 10분 동안 세척한다. 슬라이드의 측면을 수건으로 얼룩 말리고 과도한 PBS를 털어 내십시오. 각 슬라이드에 장착 매체 3방울을 추가합니다. 커버 슬립을 추가하고 공초점 현미경으로 이미징하기 전에 커버 슬립을 눌러 포셉 한 쌍으로 거품을 부드럽게 밀어 내십시오.