Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

La retina neural es un tejido muy organizado que presenta capas neuronales bien definidas. En estas, las neuronas (células ganglionares, amacrinas, bipolares, horizontales y fotorreceptoras) están interconectadas entre sí y también con células gliales de Müller (MGC) y astrocitos, lo que lleva a una adecuada fototransducción y procesamiento de la información visual ^1,2. Se sabe que los MGC tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis retiniana porque atraviesan toda la sección retiniana y, por lo tanto, pueden interactuar con todos los tipos de células que modulan múltiples procesos protectores. Se ha reportado que los MGC tienen varias funciones importantes para el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas retinianas, incluyendo la glucólisis para proporcionar energía a las neuronas, la eliminación de desechos neuronales, el reciclaje de neurotransmisores y la liberación de factores neurotróficos, entre otros ^3,4,5.

Por otro lado, la inflamación, el estrés oxidativo y nitrosativo están implicados en la patogénesis y progresión de muchas enfermedades humanas, incluidas las retinopatías ^{6,7,8,9,10,11}. El equilibrio redox en las células depende de una regulación estricta de los niveles de ROS. Las ROS se generan constantemente en condiciones fisiológicas como resultado de la respiración aeróbica principalmente. Los principales miembros de la familia ROS incluyen radicales libres reactivos como el anión superóxido (O_2͘͘͘͘^•−), radicales hidroxilo (^•OH), varios peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) y el peróxido de hidrógeno sin radicales (H₂O₂)^12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que las ROS desempeñan un importante papel de señalización en las células mediante el control de procesos esenciales. Los MGC tienen una fuerte defensa antioxidante por la activación del factor nuclear transcripcional eritroide-2 relacionado con el factor 2 (Nrf2) y la posterior expresión de proteínas antioxidantes para eliminar la producción excesiva de ROS en condiciones patológicas 14,15,16. Cuando las células pierden su equilibrio redox debido a una producción exagerada de ROS o una capacidad defectuosa para eliminar ROS, la acumulación de estrés oxidativo promueve modificaciones dañinas en proteínas, lípidos y ADN, lo que lleva al estrés celular o la muerte. El aumento del sistema de defensa antioxidante de la retina mejora la resolución y prevención de retinopatías, como roP y RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Por lo tanto, la medición de la producción de ROS en tiempo real es una herramienta poderosa y útil.

Existen varios métodos para medir la producción de ROS o el estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar directamente el estado redox de una célula 25,26,27,28. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite su escisión por esterasas intracelulares en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular, 2′,7′-diclorofluoresceína (H₂DCF). Esta molécula no fluorescente se acumula intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente DCF. La oxidación de la sonda es producto de la acción de múltiples tipos de ROS (peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico o peróxidos), que pueden detectarse mediante citometría de flujo o microscopía confocal (emisión a 530 nm y excitación a 485 nm). La limitación de esta técnica es que el superóxido y el peróxido de hidrógeno no reaccionan fuertemente con H₂DCF^25,29. En este artículo, utilizamos la sonda DCFH-DA para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Por esa razón, inducimos la producción de ROS estimulando mgC con inductor de ROS, A o B, antes de cargar las células con la sonda fluorescente. Además, utilizamos un compuesto antioxidante. Finalmente, mostramos datos representativos y fiables obtenidos utilizando este protocolo.