DetectSyn: Eine schnelle, unvoreingenommene fluoreszierende Methode zur Erkennung von Änderungen der Synapsendichte

Synapsen sind die grundlegende Einheit der Kommunikation zwischen Neuronen¹. Viele Synapsen zwischen Neuronen innerhalb derselben Regionen führen zu Schaltkreisen, die das Verhalten vermitteln². Synapsen bestehen aus einem präsynaptischen Terminal von einem Neuron, das Neurotransmitter oder Neuropeptide freisetzt, die Informationen an postsynaptische Rezeptoren eines anderen Neurons weiterleiten. Die Summe präsynaptischer Signale bestimmt, ob das postsynaptische Neuron ein Aktionspotential auslöst und die Nachricht an andere Neuronen weitergibt.

Synaptopathologie, der Abbau von Synapsen, entsteht bei Krankheiten und Störungen, die durch ein vermindertes neuronales Volumen gekennzeichnet sind, wie Alzheimer-Krankheit und schwere depressive Störung, was zu Schaltkreisen führt, die nicht mehr optimal funktionieren ^3,4,5. Die Wiederherstellung der Synapsendichte liegt wahrscheinlich der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen für diese Erkrankungen zugrunde. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass zunehmende Synapsen der Verhaltenswirksamkeit von schnellen Antidepressiva^{zugrunde liegen 6}. Um mögliche synaptopathologische Behandlungen schnell zu screenen, benötigen Forscher Techniken, die Veränderungen der Synapsenzahlen schnell identifizieren.

Aktuelle Methoden sind entweder zeitaufwendig und teuer (Elektronenmikroskopie, Array-Tomographie) oder sie untersuchen nur postsynaptische Veränderungen, ohne präsynaptische Interaktion (Wirbelsäulenanalysen, Immunfluoreszenz/-kolokalisation) einzubeziehen. Farbstoffe wie DiI oder fluoreszierende Proteine wie GFP helfen, Neuronen sichtbar zu machen und postsynaptische Stacheln zu charakterisieren. Die Wirbelsäulenanalyse verwendet jedoch von Forschern definierte Verhältnisse, um die Morphologie zu bestimmen, was die Reproduzierbarkeit verringern^{kann 7}. Darüber hinaus wird immer noch aufgedeckt, wie sich die verschiedenen Wirbelsäulenklassen auf funktionelle Synapsen beziehen⁸. Die Wirbelsäulenbildung kann vorübergehend sein und die postsynaptische Plastizität widerspiegeln, aber diese Stacheln könnten eliminiert werden, bevor sie sich mit einem präsynaptischen Neuron⁹ zu einer Synapse stabilisieren.

Die Kolokalisation bietet einen besseren Proxy für Synapsen als die Wirbelsäulenanalyse, da man eine Immunstrukturierung für präsynaptische und postsynaptische Proteine durchführen kann. Synaptische Proteine können jedoch niedrige Kolokalisationswerte ergeben, da die Proteine nebeneinander stehen und sich möglicherweise nicht konsistent überlappen. Da die Proteine nicht vollständig überlagert sind, können Kolokalisierungstechniken aufgrund dieser fehlenden Informationen Änderungen der Synapsenbildung möglicherweise nicht genau messen. Obwohl sowohl die Elektronenmikroskopie (EM) als auch die Array-Tomographie hochauflösende Bilder von Synapsen liefern, sind sie zeitaufwendig. EM erfordert außerdem spezielle Ausrüstung, und die Forscher sind auf kleine Gewebevolumina für ein bestimmtes Experiment beschränkt. Während die Array-Tomographie elegant die Möglichkeit bietet, auf ultradünne Abschnitte nach vielen Proteinen zu suchen und mit EM¹⁰ kombiniert werden kann, kann diese Technik zu arbeitsintensiv sein und den Rahmen von Experimenten sprengen, die schnell nach Veränderungen der Synapsenbildung suchen müssen.

DetectSyn ist eine spezifische Anwendung des Duolink Proximity Ligation Assay. Der PLA-Assay ermöglicht den allgemeinen Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. DetectSyn überbrückt postsynaptische Proxy-Messungen, indem es ein fluoreszierendes Signal verstärkt, das von markierten prä- und postsynaptischen Proteinen innerhalb von 40 nm voneinander emittiert wird. Wenn sich die synaptischen Proteine innerhalb von 40 nm befinden, wie in einem synaptischen Spalt, dann hybridisieren die sekundären Antikörper, die DNA-Sonden enthalten, zu zirkulärer DNA. Diese hybridisierte zirkuläre DNA exprimiert eine fluoreszierende Sonde, die dann mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken amplifiziert und nachgewiesen wird (siehe Abbildung 1). Entscheidend ist, dass diese Technik im Gegensatz zu EM und Array-Tomographie keine spezielle Ausrüstung erfordert und etwa die gleiche Zeit in Anspruch nimmt wie die Standard-Immunhistochemie. Die Zugänglichkeit dieser Technik ermöglicht es somit Forschern außerhalb forschungsintensiver Institutionen, an der synaptopathologischen Forschung teilzunehmen. Darüber hinaus kann diese Technik Veränderungen der synaptischen Dichte in mehreren Gehirnregionen innerhalb eines einzigen Experiments untersuchen und bietet eine ganzheitlichere Darstellung synaptischer Veränderungen aufgrund von Krankheit oder Behandlung.