Summary

DetectSyn: طريقة فلورسنت سريعة وغير متحيزة للكشف عن التغيرات في كثافة المشبك

Published: July 22, 2022
doi:

Summary

DetectSyn هو اختبار فلورسنت سريع وغير متحيز يقيس التغيرات في عدد المشبك النسبي (المشاركة قبل وبعد المشبكي) عبر العلاجات أو الحالات المرضية. تستخدم هذه التقنية تقنية ربط القرب التي يمكن استخدامها في كل من الخلايا العصبية المستزرعة والأنسجة الثابتة.

Abstract

نقاط الاشتباك العصبي هي موقع التواصل بين الخلايا العصبية. ترتبط قوة الدائرة العصبية بالكثافة المشبكية ، وانهيار نقاط الاشتباك العصبي هو سمة من سمات الحالات المرضية مثل الاضطراب الاكتئابي الرئيسي (MDD) ومرض الزهايمر. تشمل التقنيات التقليدية للتحقيق في أعداد المشبك التعبير الجيني لعلامات الفلورسنت (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)) ، والأصباغ التي تملأ الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، صبغة الكربوسيانين ، DiI) ، والكشف عن الفلورسنت المناعي لعلامات العمود الفقري (على سبيل المثال ، كثافة ما بعد المشبكي 95 (PSD95)). أحد التحذيرات الرئيسية لهذه التقنيات الوكيلة هو أنها تحدد فقط التغييرات ما بعد المشبكية. ومع ذلك ، فإن المشبك هو اتصال بين محطة ما قبل المشبكي والعمود الفقري ما بعد المشبكي. يتطلب المعيار الذهبي لقياس تكوين / إزالة المشبك الداخلي إجراء مجهر إلكتروني مستهلك للوقت أو تقنيات التصوير المقطعي المصفوفي. وتتطلب هذه التقنيات تدريبا متخصصا ومعدات مكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم عدد محدود فقط من الخلايا العصبية واستخدامها لتمثيل التغييرات في منطقة الدماغ بأكملها. DetectSyn هي تقنية فلورسنت سريعة تحدد التغييرات في تكوين المشبك العصبي أو القضاء عليه بسبب حالة مرضية أو نشاط دوائي. يستخدم DetectSyn مقايسة ربط القرب السريع للكشف عن البروتينات المتجاورة قبل وبعد المشبكي والمجهر الفلوري القياسي ، وهي تقنية متاحة بسهولة لمعظم المختبرات. يسمح الكشف الفلوري عن الثقب الناتج بتحليل سريع وغير متحيز للتجارب. يوفر DetectSyn نتائج أكثر تمثيلا من المجهر الإلكتروني لأنه يمكن تحليل مساحات أكبر من عدد محدود من الخلايا العصبية الفلورية. علاوة على ذلك ، يعمل DetectSyn على الخلايا العصبية المستزرعة في المختبر وشرائح الأنسجة الثابتة. أخيرا ، يتم توفير طريقة لتحليل البيانات التي تم جمعها من هذه التقنية. بشكل عام ، يقدم DetectSyn إجراء للكشف عن التغيرات النسبية في كثافة المشبك عبر العلاجات أو الحالات المرضية وهو أكثر سهولة من التقنيات التقليدية.

Introduction

نقاط الاشتباك العصبي هي الوحدة الأساسية للتواصل بين الخلايا العصبية1. العديد من نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية داخل نفس المناطق تؤدي إلى دوائر تتوسط السلوك2. تتكون المشابك العصبية من طرف ما قبل المشبكي من خلية عصبية واحدة تطلق ناقلات عصبية أو ببتيدات نيوروببتيدات تنقل المعلومات إلى مستقبلات ما بعد المشبكي لخلية عصبية أخرى. يحدد جمع الإشارات قبل المشبكي ما إذا كانت الخلايا العصبية ما بعد المشبكي ستطلق إمكانات عمل وتنشر الرسالة إلى الخلايا العصبية الأخرى.

ينشأ علم الأمراض المشبكي ، وهو انهيار نقاط الاشتباك العصبي ، في الأمراض والاضطرابات التي تتميز بانخفاض الحجم العصبي ، مثل مرض الزهايمر والاضطراب الاكتئابي الرئيسي ، مما يؤدي إلى دوائر لم تعد تؤدي على النحو الأمثل3،4،5. من المحتمل أن تكون استعادة كثافة المشبك الداخلي وراء فعالية العلاجات المحتملة لهذه الاضطرابات. على سبيل المثال ، ثبت مؤخرا أن زيادة نقاط الاشتباك العصبي تكمن وراء الفعالية السلوكية لمضادات الاكتئاب السريعة6. لفحص علاجات التشابك العصبي المحتملة بسرعة، يحتاج الباحثون إلى تقنيات تحدد بسرعة التغييرات في أرقام المشبك العصبي.

المنهجيات الحالية إما مستهلكة للوقت ومكلفة (المجهر الإلكتروني ، التصوير المقطعي المصفوفي) ، أو أنها تدرس فقط التغيرات ما بعد المشبكي دون دمج المشاركة قبل المشبكي (تحليلات العمود الفقري ، التألق المناعي / التوطين المشترك). تساعد الأصباغ مثل DiI أو البروتينات الفلورية مثل GFP على تصور الخلايا العصبية وتوصيف العمود الفقري بعد المشبكي. ومع ذلك ، يستخدم تحليل العمود الفقري النسب التي يحددها الباحث لتحديد المورفولوجيا ، والتي يمكن أن تقلل من قابلية التكاثر7. علاوة على ذلك ، لا يزال يتم الكشف عن كيفية ارتباط فئات العمود الفقري المختلفة بالمشابك الوظيفية8. يمكن أن يكون تكوين العمود الفقري عابرا وقد يعكس اللدونة ما بعد المشبكي ، ولكن يمكن القضاء على هذه العمود الفقري قبل الاستقرار في مشبك عصبي مع خلية عصبية ما قبل المشبكي9.

يوفر التوطين المشترك وكيلا أفضل للمشابك العصبية من تحليل العمود الفقري لأنه يمكن للمرء أن يصبغ المناعة للبروتينات قبل المشبكي وما بعد المشبكي. ومع ذلك ، قد تنتج البروتينات المشبكية قيم توطين مشتركة منخفضة لأن البروتينات متجاورة وقد لا تتداخل باستمرار. وبالتالي ، نظرا لأن البروتينات ليست متراكبة بالكامل ، فقد لا تقيس تقنيات التوطين المشترك بدقة التغييرات في تكوين المشبك العصبي بسبب هذه المعلومات المفقودة. أخيرا ، على الرغم من أن كل من المجهر الإلكتروني (EM) والتصوير المقطعي المصفوفي يوفران صورا عالية الدقة للمشابك العصبية ، إلا أنهما يستهلكان وقتا طويلا. يتطلب EM أيضا معدات متخصصة ، ويقتصر الباحثون على كميات صغيرة من الأنسجة لأي تجربة معينة. في حين أن التصوير المقطعي بالصفيف يوفر بأناقة القدرة على فحص العديد من البروتينات على أقسام رقيقة للغاية ويمكن دمجها مع EM10 ، فقد تكون هذه التقنية كثيفة العمالة للغاية وتتجاوز نطاق التجارب التي تحتاج إلى المسح السريع بحثا عن التغييرات في تكوين المشبك.

DetectSyn هو تطبيق محدد لفحص ربط القرب Duolink. يسمح فحص PLA بالكشف العام عن التفاعلات بين البروتين والبروتين. يقوم DetectSyn بسد المقاييس الوكيلة لما بعد المشبكي عن طريق تضخيم إشارة الفلورسنت المنبعثة من البروتينات الموسومة قبل وبعد المشبكي في غضون 40 نانومتر من بعضها البعض. إذا كانت البروتينات المشبكية في حدود 40 نانومتر ، كما هو الحال داخل شق متشابك ، فإن الأجسام المضادة الثانوية ، التي تحتوي على مجسات الحمض النووي ، سوف تهجن إلى حمض نووي دائري. يعبر هذا الحمض النووي الدائري الهجين عن مسبار فلورسنت ، يتم تضخيمه واكتشافه باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفلوري القياسية (انظر الشكل 1). والأهم من ذلك، على عكس التصوير المقطعي الكهرومغناطيسي والتصوير المقطعي المصفوفي، أن هذه التقنية لا تتطلب معدات متخصصة وتستغرق نفس الوقت تقريبا مثل الكيمياء النسيجية المناعية القياسية. وبالتالي ، فإن إمكانية الوصول إلى هذه التقنية تمكن الباحثين خارج المؤسسات كثيفة البحث من المشاركة في أبحاث علم الأمراض العصبي. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه التقنية فحص التغيرات في كثافة المشبكية في مناطق دماغية متعددة ضمن تجربة واحدة ، مما يوفر تمثيلا أكثر شمولية للتغيرات المشبكية بسبب المرض أو العلاج.

Protocol

تم عزل الخلايا والأنسجة عن الحيوانات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمد من قبل لجنة ويك فورست المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على العينات التي تمت معالجتها بالفعل وتثبيتها وفقا لنماذج ومتطلبات تجريبية محدد…

Representative Results

يتم تقديم البيانات المعدلة من Heaney et al.6 لإثبات تجربة يتوقع فيها زيادة تكوين المشبك العصبي (يرجى الاطلاع على6 لمزيد من المعلومات ومناقشة أكثر تعمقا للآلية). في السابق ، ثبت أن مضادات الاكتئاب السريعة تتطلب تنشيط مستقبلات التمثيل الغذائي المثبطة ، GABAB (النوع الفرعي ل…

Discussion

DetectSyn هو فحص سريع يستخدم مقايسة ربط القرب للكشف عن البروتينات داخل 40 نانومتر من بعضها البعض ، مما يسمح بالكشف عن تكوين المشبك. تعمل هذه التقنية على تحسين اختبارات الفلورسنت الحالية ، والتي تعمل فقط كقياسات بديلة لتشكيل المشبك العصبي. يكتشف DetectSyn التغيرات القابلة للقياس الكمي في البروتينات…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NINDS R01 NS105005 (KRG) و NS105005-03S1 (KRG) ، وزارة الدفاع USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG) ، NIAAA R01AA016852 ، NIAAA T32AA007565 (CFH) ، ومنحة من FRAXA Research (CFH) وجمعية الزهايمر ، AARG-NTF-21-852843 (KRG) ، AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Materials

10x PBS Fisher Scientific BP39920 PBS made in house works, as well.
24 well plates Fisher Scientific FB012929 For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.
50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
Aluminium foil Fisher Scientific 15-078-290
Chicken anti-MAP2 antibody Abcam ab5392
Clear nail polish Fisher Scientific NC1849418 Other clear nail polish works, as well.
Cold block Fisher Scientific 13131012
Computer workstation HP
Confocal or fluorescent microscope Nikon A1R HD25
Donkey anti-chicken FITC Fisher Scientific SA1-72000
Duolink donkey anti-Mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink donkey anti-Rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink In Situ Detection Reagents Far Red Sigma DUO92013 Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma DUO82049 Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.
Fine-tipped paintbrush Fisher Scientific NC9691026 Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12545MP Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 1255015 For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.
Freezer, -20°C VWR 76449-108
Glass coverslips Fisher Scientific 125480
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Image processing software e.g. NIS Elements, ImageJ
Incubator Fisher Scientific 15-015-2633
Large petri dish, 100mm Fisher Scientific FB0875712
Molecular grade water Fisher Scientific BP24701
Mouse anti-Synapsin1 antibody Synaptic Systems 106-011
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Orbital shaker Fisher Scientific 02-106-1013
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Pipette tips Fisher Scientific 02-707-025
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100 Working volumes range from 3 µL to 500 µL
Plastic pasteur pipette Fisher Scientific 02-708-006
Precision tweezers/foreceps Fisher Scientific 12-000-122
Rabbit anti-PSD95 antibody Abcam ab18258 Other antibody pairs may work, as well, with optimization.
Refrigerator VWR 76470-402
Small petri dish, 60 mm Fisher Scientific FB0875713A
Timer Fisher Scientific 14-649-17
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100

References

  1. Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
  2. Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  3. Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
  4. Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
  5. van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
  6. Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
  7. Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
  8. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
  9. Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  10. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  13. Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
  14. Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).

Play Video

Cite This Article
Heaney, C. F., McArdle, C. J., Raab-Graham, K. F. DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density. J. Vis. Exp. (185), e63139, doi:10.3791/63139 (2022).

View Video