结合近紫外光刻和牵引力显微镜来测量微图案水凝胶上的细胞力。单细胞的靶向光诱导释放可以对同一样品进行大量测量。
牵引力显微镜(TFM)是机械生物学中用于测量细胞力的主要方法。这通常用于粘附在平坦软基板上的细胞,这些基质在细胞牵引(2D-TFM)下变形。TFM依赖于线性弹性材料的使用,例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚丙烯酰胺(PA)。对于PA上的2D-TFM,实现高通量的困难主要是由于电池形状和牵引力的较大可变性,需要标准化。我们提出了一种方案,用于快速有效地制造用于2D-TFM研究的微图案PA水凝胶。微图案首先通过使用近紫外光的无掩模光刻法创建,其中细胞外基质蛋白仅与微图案区域结合,而表面的其余部分对于细胞保持非粘附性。细胞外基质蛋白的微模式化是由于活性醛基团的存在,导致不同形状的粘附区域以适应单个细胞或细胞组。对于TFM测量,我们使用不同弹性的PA水凝胶,通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的量并跟踪嵌入荧光珠的位移,以使用正则化的傅里叶变换牵引细胞术(FTTC)重建细胞牵引场。
为了进一步精确记录细胞力,我们描述了使用受控剂量的图案化光在单个细胞或细胞组的定义区域中释放细胞牵引力。我们称这种方法为局部紫外照明牵引力显微镜(LUVI-TFM)。通过酶处理,所有细胞同时从样品中分离出来,而使用LUVI-TFM可以按顺序记录样品不同区域的细胞的牵引力。我们证明了该协议的适用性(i)研究细胞牵引力作为对底物的受控粘附的函数,以及(ii)从同一样品中获得更多的实验观察结果。
当与细胞外环境相互作用时,贴壁细胞施加的力主要由基于整合素的局灶性粘连介导,将细胞外基质(ECM)连接到肌动蛋白细胞骨架。局灶性粘连是多蛋白组件,其中心是整合素与ECM蛋白(如纤连蛋白和胶原蛋白)的结合。整合素聚集和局灶性粘连的生长不仅对于建立机械稳定的连接至关重要,而且对于招募其他局灶性粘附蛋白也至关重要,包括那些激活RhoA途径以调节细胞收缩力的蛋白1。肌动蛋白细胞骨架的RhoA依赖性收缩性允许细胞在底层ECM上扩散和迁移,并感知其刚度2。牵引力的分布很大程度上取决于细胞的扩散面积和形状,两者都依赖于基质特性,因此会影响细胞骨架组织,最终在基质力学和细胞骨架组织之间形成一个闭合的反馈回路3,4。
表面微图案技术允许通过创建呈现ECM粘合蛋白的微米级区域来定义对细胞形状的控制;根据这些区域的大小,单个细胞或粘附在微模式上的细胞组5。ECM蛋白可以通过不同的方法在玻璃基板上进行图案化,例如微接触打印,照片图案化或激光图案化6。紫外光(λ = 185 或 375 nm)与表面防污策略相结合,为设计不同形状和尺寸以及固定多种蛋白质类型提供了灵活性,并具有高精度的近表面边缘7,8。涂有驱蛋白化学品(如聚乙二醇(PEG))的区域使用铬光掩模或基于数字镜面设备(DMD)的无掩模光刻系统进行保护。面罩中的图案允许暴露在紫外线下的区域,然后用ECM蛋白质进行图案化。使用ECM蛋白对水凝胶表面进行图案化需要一个转移步骤,以从玻璃表面去除蛋白质并将其交联到图案上。或者,可以通过首先用驱虫蛋白涂覆光掩模,然后使用深紫外光照射燃烧未掩模的区域来实现软材料的图案化。由于深紫外光产生臭氧并使表面对蛋白质结合具有反应性,因此未屏蔽的区域涂有ECM蛋白,最后凝胶直接聚合在未屏蔽区域的顶部9,10。
图案化水凝胶可用于执行TFM,这是一种测量细胞 – 材料界面处细胞力的技术11。在2D-TFM中,人们使用厚聚合物薄膜的平坦表面,其中嵌入标记珠以跟踪变形12,13,14,15。为了提取位移矢量,必须将两个图像(一个变形状态和一个无变形的参考图像)组合在一起。然后,通过图像处理将两个图像映射到彼此上。在高标记密度下,这通常使用粒子图像测速(PIV)来完成,这是一种重建流体动力流动的成熟方法。在低标记密度和3D-TFM中,这通常使用粒子跟踪测速(PTV)来完成,其中包括实验数据集的特定特征。计算成本更低的替代方案的一个例子是光流,例如Kanade-Lucas-Tomasi(KLT)算法16。在水凝胶底物的情况下,荧光珠通常在材料聚合过程中以高密度嵌入,并且在酶分离时记录细胞释放之前和之后的图像。贴壁细胞的酶促脱离,例如,通过胰蛋白酶消化,导致同时从水凝胶上的所有细胞释放细胞牵引,使得难以从大量细胞中获得详细的分析。
在这里,我们提出了一种制备微图案水凝胶以控制细胞形状和定位的方案,以及一种使用UV将单个细胞从底物中分离的连续有效测量牵引力的方法。对于牵引力测量,我们提出了一种生产双层PA水凝胶的技术,其中荧光珠仅嵌入顶层,这增加了它们的密度并减少了它们的垂直扩散。将紫外线介导的细胞牵引力释放与微模式相结合,使得可以获得对细胞脱离的空间控制(例如,单个细胞而不影响感兴趣区域中其他细胞的粘附),前提是图案化细胞之间有足够的距离。然后使用最有效和最可靠的2D-TFM方法重建细胞牵引,即具有正则化的傅里叶变换牵引细胞术(FTTC)17,18。
在该协议中,我们描述了含有荧光珠的微图案PA水凝胶的制备,其用作TFM研究的基准标记。我们的方法基于三个步骤:1)制备双层PA水凝胶;2)ECM蛋白的微图案化及其转移到水凝胶表面;3)使用图案化的近紫外光进行TFM。分析细胞对基板的牵引力的实验设置需要使用具有已知刚度值的线性弹性材料来计算与荧光珠位移相关的力26。PA水凝胶易于制备,刚度易于调整,通常用于刚度传感和TFM18,28。然而,为了获得整个水凝胶的可重复聚合时间和均匀聚合,应注意试剂的储存条件和时间,例如,应将APS保存在干燥器中以避免失去其活性;应保护TEMED免受直射光的影响。使用氧化HEA允许基质蛋白在水凝胶表面上共价结合,这可能有利于实现完整和稳定的蛋白质层的形成。每次制造PA水凝胶时,氧化的HEA溶液都应新鲜制备。双层PA水凝胶具有三个主要优点:1)它提供了一种替代方法,可以在水凝胶表面附近可重复地获得丝状珠的均匀分布,而无需使凝胶变得非常薄(即<20μm)。控制水凝胶厚度对于使用TFM获得准确的测量结果至关重要。当弹性基板太薄时,强贴壁细胞(如成纤维细胞)可能会感知并机械地响应下面的刚性玻璃基板29,30。厚水凝胶使力重建的图像采集更具挑战性。此外,考虑到用于附着水凝胶的玻璃基板的额外厚度,许多显微镜将没有足够的空间容纳它们,除非使用超薄显微镜载玻片。2)在双层PA水凝胶中,PA水凝胶表面附近丝状微球的均匀分布是在不使用离心机的情况下实现的,而是通过简单孵育精确量的水凝胶溶液和荧光珠来实现的。在执行PIV分析时,高磁珠密度具有显着的优势,因为它增加了牵引力的分辨率和信噪比,而无需共聚焦显微镜。3) 将磁珠限制在靠近细胞-材料界面的薄层中,可以使用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜对牵引力进行成像。在制备水凝胶时,用户应确保其牢固地粘附在底部玻璃上,然后再继续执行协议的后续步骤。我们建议遵循水凝胶层聚合指示的孵育时间,因为可能很难在不损坏水凝胶表面的情况下去除表面顶部的玻璃。
测量弹性性能的最知名技术是AFM,纳米压痕,拉伸试验和流变测量。然而,纳米压痕会在材料上引起非常高的应变,从而影响弹性性能的测定。另一方面,拉伸试验和流变测量是宏观测量技术,而细胞在微观尺度上相互作用31,32。AFM允许在生理条件下以减少菌株的微尺度测量。如果缺少实验细节(例如,压痕力和速度)或记录的数据不足,AFM测量的可靠性可能会受到不利影响27。Huth等人描述了一种从AFM数据中提取杨氏模量的算法,该算法强调保持测量细节恒定27。该算法提供了对杨氏模量的精确和可靠的测定,并用于我们的实验。此外,我们在不同日期制造的样品上测量了许多曲线,并获得了非常相似的结果(约1-2 kPa的平均值的变化)。这表明可以可靠地预测我们凝胶的刚度。
在该协议中,我们使用光图案模块在玻璃上创建微图案区域,然后将其转移到水凝胶表面。该协议中所示的微图案基于基于DMD(数字微镜器件)的无掩模近UV光刻(λ = 375 nm)7。DMD由芯片上的大量微镜组成。单个像素对应于单个微镜。来自计算机的像素化图案图像文件通过DMD投影,并使用物镜聚焦在表面上。对于蛋白质的微图案化,聚焦激光用于在光引发剂的帮助下切割驱虫性聚合物刷。之后,暴露的区域充满ECM蛋白。这种无掩模烧蚀方法在设计新图案时提供了极大的灵活性,因为它不依赖于光掩模的使用。设计和应用模式非常简单,因为使用像Inkscape这样的免费软件只需要几分钟。然而,在短时间内产生的图案和样品的数量是一个主要缺点,因为这种方法每次只能用于图案化单个基板。光模式模块使用发射几毫瓦的近紫外固态激光源。非屏蔽激光束对眼睛和皮肤是危险的。反射和散射的光和辐射也可能是危险的。处理必须附有激光官员的安全说明。使用光图案模块时,协议中最关键的步骤是确保在微图案化和烧蚀过程中,激光正确聚焦在表面上。在图案化过程中,紫外线的一致照射剂量(强度乘以时间)取决于激光在表面上聚焦的方式。由于聚焦不良而导致表面强度较弱可能导致ECM转移到水凝胶表面的失败,从而导致没有细胞附着在水凝胶上。
在TFM实验中,在贴壁细胞和基准标记物的初始成像之后,通过胰蛋白酶处理将细胞从PA水凝胶中释放出来以记录其放松状态。执行此步骤的缺点是在显微镜载物台上处理样品。如果没有灌注室,打开培养皿的盖子,吸出培养基,冲洗和移液胰蛋白酶溶液对初学者和有经验的用户来说都是一个挑战。事实上,这些程序是 xyz 轴漂移的主要来源,导致位置和焦点的损失。我们的局部紫外线照明协议使TFM成为初学者更容易获得的技术。应该注意的是,我们使用的是市售的基于显微镜的无掩模光图案模块,但原则上可以使用任何UV-A照明系统,最终与掩模结合使用以保护基板的区域,其中不应记录细胞牵引力。用大量低波长可见光(例如,激发DAPI发射的紫光)暴露细胞将导致氧化应激增加,这可能导致光毒性和细胞死亡。因此,该技术甚至可以应用于没有紫外激光模块的落射荧光显微镜。然而,由于强度要弱得多,在这种情况下,用酶处理完成TFM会容易得多。
使用LUVI-TFM,由于单个细胞或小组细胞的局部分离,可以使用相同的样品进行多次测量。但是,应注意选择要分离的单元,以避免来自相邻单元的记录力。因此,对于没有微图案的单细胞测量,应避免拥挤的区域;对于单个微图案细胞的测量,图案设计应使单个结构之间的距离至少是图案区域直径的两倍。我们还建议不要按顺序使用来自相邻模式的细胞,而是从底物上的远处区域采样它们。我们的测量在配备聚焦控制功能和40 x air NA = 0.9透镜的落射荧光显微镜上进行,其中透镜的工作距离足够长,并且从一个孔到另一个孔的快速移动是高度可调的。用于TFM应用的细胞靶向分离对于测量单个细胞或整个小细胞簇(例如,直径达300μm)的细胞力是有效的。使用我们的设置,我们观察到单个细胞UV处理的细胞舍入和脱离(图3A),而小细胞簇很少发生脱离。这可能导致对细胞牵引力的低估。对于较大的细胞簇,建议进行酶分离,因为用户应使用20倍空气物镜对整个细胞簇进行成像,并且需要聚焦控制功能。由于20倍空气镜头的焦深要长得多,因此处理将不如高倍率物镜那么重要。用户应确保正确设置了用于细胞消融的焦点,因为照明剂量取决于表面上的激光聚焦。虽然我们意识到由于与相邻未处理的细胞可能存在机械相互作用,因此在细胞集合体中使用LUVI-TFM可能存在局限性,但这一方面实际上对于靶向细胞挤出机制的研究很有用,例如,来自上皮单层。
总之,通过我们的TFM方法与微图案细胞的光诱导释放相结合,我们提供了一种强大且高通量的方案来测量细胞粘附力。这种方法的多功能性可以通过显微镜和成像设置进一步利用,旨在提高分辨率和灵敏度。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢丽贝卡·阿尔瓦拉多夫人对协议视频制作的支持,并感谢斯蒂芬·卡萨莱先生对手稿的建设性批评。我们感谢马克斯普朗克医学研究所细胞生物物理系的同事所做的有益讨论。从Max-Planck-Gesellschaft到E.A.C.-A.的财政支持。和Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG SFB1129,Projektnummer 240245660,P15至E.A.C.-A.和P4至U.S.S.;DFG EXC 2082/1-390761711 至 美国)也得到了极大的认可。J.B. 感谢卡尔蔡司基金会的财政支持。E.A.C-A.,C.S.和USS.承认通过德国联邦教育和研究部(BMBF)支持的Max Planck School Matter to Life提供资金。C.S.由欧洲研究理事会(Consolidator Grant PHOTOMECH,编号:101001797)提供支持。
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
UV Pattening module | #PRIMO | Alveole | |
UVO cleaner | #342-220 | Jelight |