Summary

Radyoaktif Sinyalin Hücresel Kökenini Belirlemek için Floresan Aktive Hücre Sıralama-Radyoligand ile Tedavi Edilmiş Doku (FACS-RTT)

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

Floresan-Aktif Hücre Sıralama-Radyoligand Tedavi Edilen Doku (FACS-RTT), Alzheimer Hastalığında 18 kDa translokatör proteininin veya Serotonin 5HT2A-reseptör ekspresyonunun hücresel ölçekte rolünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, TgF344-AD sıçan modelinde FACS-RTT’nin ex-vivo uygulamasını açıklar.

Abstract

Glial hücreler muhtemelen Alzheimer hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir etkiye sahiptir. Değişiklikleri belki de pro-inflamatuar bir durumla ilişkilidir. TgF344-AD sıçan suşu, insan APP ve insan PS1ΔE9 genlerini ifade etmek, amiloid proteinleri Aβ-40 ve Aβ-42’yi kodlamak ve yaşlanma ile birlikte amiloid patolojisini ve bilişsel eksiklikleri göstermek için tasarlanmıştır. Bu çalışmada TgF344-AD sıçan modeli, 18 kDa translokatör proteininin (TSPO, glial hücre aktivasyonunun bir belirteci) bağlanmasının hücresel kökenini ve AD’de muhtemelen bozulmuş olan 5HT2A-reseptörü (5HT2AR) serotonin reseptör seviyelerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada sunulan teknik, in vivo PET veya SPECT veya ex vivo / in vitro otoradyografi tekniklerini tamamlayan kantitatif hücre tipine özgü bir teknik olan Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS-RTT) ‘dir. Sitometri hücre sıralamadan sonra bir γ sayacı kullanarak, görüntüleme için daha önce kullanılan aynı radyoaktif etiketli izleyiciyi ölçer. Bu, radyoaktif etiketli proteinin hücresel kökeninin yüksek hücresel özgüllük ve hassasiyetle belirlenmesini sağlar. Örneğin, FACS-RTT ile yapılan çalışmalar, (i) TSPO bağlanmasındaki artışın, lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı nöroinflamasyonun bir sıçan modelinde mikroglia ile ilişkili olduğunu, (ii) 12 ve 18 aylarda TSPO bağlanmasındaki bir artışın önce astrositlerle ilişkili olduğunu ve daha sonra TgF344-AD sıçanlarında vahşi tip (WT) sıçanlara kıyasla mikroglia ve (iii) 5HT2A’nın striatal yoğunluğunun ilişkili olduğunu göstermiştir. R, aynı sıçan AD modelinde astrositlerde 18 ayda azalır. İlginç bir şekilde, bu teknik neredeyse tüm radyotracerlere genişletilebilir.

Introduction

Alzheimer Hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif hastalıklar, artan semptomlarla ilişkili nöronal bir kayıp ile karakterizedir. Demansın en sık nedeni olan ve vakaların %60-%70’ini oluşturan AD, dünya çapında yaklaşık 50 milyon insanı etkilemektedir1. Nöropatolojik düzeyde, AH’nin iki ana özelliği, hücre dışı amiloid-β (Aβ) plaklarının ve hücre içi Tau nörofibriler yumakların birikmesidir. Glial hücre değişiklikleri ayrıca AD2 ve çeşitli nörotransmitter sistemlerin olası bozulması ile ilişkilendirilmiştir 3,4.

TgF344-AD sıçan hattı, insan APP ve PS1 ΔE9 transgenlerini eksprese ederekAD’yi modellemek için modifiye edilmiştir, bu da çözünür ve çözünmez Aβ-40 ve Aβ-42 ekspresyonuna ve amiloid plak oluşumuna yol açmıştır5. Aynı zamanda Tau proteininin hiperfosforile formlarının birikmesini ve tauopatiye yol açmasını sağlar. 9-24 aylıktan itibaren, sıçanlar giderek AD’nin patolojik özelliklerini ve bilişsel bir bozukluk 5,6,7,8,9’u geliştirir.

Pozitron Emisyon Tomografisi (PET), Tek Foton Emisyon bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve otoradyografi, γ ışınlarının emisyonuna ve nicelleştirilmesine dayanan tekniklerdir. Radyotracerler in vivo (PET ve SPECT) veya ex vivo/in vitro (otoradyografi) olarak ölçülür. Bu hassas teknikler, AD gibi çeşitli beyin hastalıklarının mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Gerçekten de, nöroinflamasyon açısından, bir in vivo nöroinflamasyon belirteci olan 18 kDa Translokatör Proteinini (TSPO), [11 C]-(R)-PK11195 veya [11 C] PBR28 gibi radyoaktif etiketli izleyicilerle değerlendiren birçok çalışma vardır (gözden geçirme için bkz.10). Ek olarak, nörotransmitter sistemlerinin değişiklikleri radyotracer11,12,13 kullanılarak incelenmiştir.

Bununla birlikte, bu teknikler radyoaktif sinyalin hücresel kökenini belirlemez. Bu, PET / SPECT’de bir radyoligandın bağlanmasındaki değişikliğin biyolojik temellerinin yorumlanmasını engelleyebilir. Örneğin, TSPO’nun nöroinflamasyon çalışmaları söz konusu olduğunda, TSPO’nun artmasının veya azalmasının astrositik veya mikroglial değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak çok önemlidir. Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktive Hücre Sıralama (FACS-RTT) tekniği, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve her hücre tipinde radyoligand bağlanmasının ayrı ayrı değerlendirilmesine ve hücre başına hedef-protein yoğunluğunun miktarına izin verir. Bu yenilikçi teknik sonuç olarak tamamlayıcıdır ve PET ve SPECT görüntüleme ile son derece uyumludur.

Burada, bu teknik iki eksen boyunca uygulandı: TSPO’ya özgü radyoligandlar kullanılarak nöroinflamasyonun incelenmesi ve serotonerjik sistemin değerlendirilmesi. İlk eksende amaç, akut inflamatuar reaksiyona yanıt olarak TSPO sinyalinin hücresel kökenini anlamaktı. Bu nedenle, FACS-RTT, bir lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonu yoluyla nöroinflamasyonun indüklenmesinden sonra ve in vivo [125I] CLINDE SPECT görüntüleme çalışmasının ardından sıçanların beyin dokularında kullanılmıştır. Ayrıca, aynı görüntüleme ve FACS-RTT protokolü 12 ve 24 aylık TgF344-AD sıçanlarına ve eşleşen vahşi tip (WT) sıçanlara uygulandı. İkinci eksen, bu sıçan modelindeki serotoninerjik sistem değişikliklerinin kökenini, hücre tipine göre ex vivo 5-HT2A Ryoğunluk değerlendirmesi yoluyla belirlemeyi amaçlamıştır.

Protocol

Tüm deneysel prosedürler, sırasıyla Cenevre Kantonu İnsan ve Hayvan Deneyleri Etik Komitesi, Kanton Araştırma Etiği Komisyonu (CCER) ve Cenevre Kantonu Sağlığının Genel Yönü (İsviçre) ile mutabık kalınarak yürütülmüştür. Veriler, Hayvan Araştırması: In-vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) yönergelerini izleyerek bildirilmiştir. 1. SPECT kamera hazırlığı ve kalibrasyonu Fotoğraf makinesini açın, işletim yazılımını yükleyin …

Representative Results

WT sıçanları, tek taraflı LPS enjeksiyonundan sonra [125I] CLINDE radyotracer ile in vivo SPECT taraması yaşadı (Şekil 2). Bu tarama (radyotracer enjeksiyon sonrası 45-60 dakikalık görüntülerden elde edilen toplam verileri kullanarak), LPS enjeksiyonu bölgesinde (Şekil 2A) beynin kontralateral bölgesinden daha yüksek [125I] CLINDE bağlanmasını göstermiştir (Şekil 2B). FACS-RTT uy…

Discussion

Bildiğimiz kadarıyla, bu teknik, hücresel düzeyde bir radyotracer’in in vivo bağlanma değişikliklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayan bir yaklaşımı tanımlayan ilk tekniktir. Protokol, örnek olarak [125 I]CLINDE (TSPO) veya [125 I]R91150(5HT 2AR) kullanarak hücresel düzeyde radyotracer bağlanmasını ölçmek için çok ölçeklibiryöntemi açıklar.

Bu teknik, LPS tarafından indüklenen yoğun bir enflamatuar reaksiyondan, AD’ni…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. 320030-184713). Yazarlar BBT ve KC, Velux Vakfı tarafından desteklenmektedir (proje n. 1123). Yazar ST, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı’ndan destek aldı (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Prof. Dr. Max Cloetta Vakfı (Klinik Tıp Plus bursu) ve Jean ve Madeleine Vachoux Vakfı.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich
Acetonitrile Sigma-Aldrich
BioVet BioVet Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur University Hospital of Geneva Virucide
Fc Block / anti-CD32 BD Biosciences BDB550270 Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90 Biolegend 202504 Reactivity for rat
Heparin B. Braun B01AB01
HPLC Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm BD Biosciences 321312 24 G catheter
Isoflurane Baxter ZDG9623
Lacryvisc Alcon 2160699
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Micropore soft tape 3M F51DA01
MILabs-Uspect II MILabs Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios Beckman Coulter Cell sorter
Myelin Removal Beads II Miltenyi Biotec 130-096-733 Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution B. Braun 395202
Neural Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet Amazon CMN-0074-10YD 40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
R91150 précursor CERMN
Sep-Pak C18 Column Waters Concentration column
Sodium iodide Na125 PerkinElmer
Tributylin precursor CERMN
U-SPECT Rec2.38c MILabs Version Rec2.38c Software for SPECT images reconstruction
USPECT II MILabs Spect Camera
Wizard 3" PerkinElmer Gamma counter

References

  1. Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer’s disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
  2. Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 4, 575-590 (2018).
  3. D’Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer’s disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
  4. D’Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer’s disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
  5. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  6. Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer’s disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
  7. Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer’s disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
  8. Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer’s disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
  9. Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
  10. Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer’s disease. Cells. 9 (9), (2020).
  11. Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
  12. Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
  13. Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
  14. Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
  15. Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
  16. Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).

Play Video

Cite This Article
Amossé, Q., Ceyzériat, K., Tsartsalis, S., Tournier, B. B., Millet, P. Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal. J. Vis. Exp. (175), e62883, doi:10.3791/62883 (2021).

View Video