Summary

تكييف الجهاز الهضمي للعدوى المسببة للأمراض وتسلسل الخلايا المفردة تحت ظروف السلامة البيولوجية المستوى 3 (BSL-3)

Published: September 10, 2021
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إصابة الأعضاء المعوية البشرية من جانبها apical أو basolateral لتوصيف التفاعلات المضيف / الممرض على مستوى الخلية الواحدة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq).

Abstract

الأجهزة المعوية البشرية تشكل أفضل نموذج الخلوية لدراسة العدوى المسببة للأمراض في الجهاز الهضمي. يمكن اشتقاق هذه الأجهزة العضوية من جميع أقسام الجهاز الهضمي (المعدة ، جيجونوم ، الاثني عشر ، الايليوم ، القولون ، المستقيم) ، وعند التمايز ، تحتوي على معظم أنواع الخلايا الموجودة بشكل طبيعي في كل قسم على حدة. على سبيل المثال، تحتوي الأجهزة العضوية المعوية على خلايا إدخالية تمتص المغذيات، وخلايا إفرازية (غوبلت، بانيث، وأمعاء الغدد الصماء)، والخلايا الجذعية، وكذلك جميع وسيطات التمايز الخاصة بالنسب (على سبيل المثال، أنواع الخلايا المبكرة أو غير الناضجة). أكبر ميزة في استخدام الأجهزة العضوية المشتقة من الجهاز الهضمي لدراسة الأمراض المعدية هي إمكانية تحديد نوع الخلية المستهدفة بدقة من قبل الممرض المعوي ومعالجة ما إذا كانت الأقسام المختلفة من الجهاز الهضمي وأنواع خلاياها المحددة تستجيب بالمثل لتحديات مسببات الأمراض. على مدى السنوات الماضية، تم استخدام نماذج الجهاز الهضمي، فضلا عن organoids من الأنسجة الأخرى، لدراسة التروبليسم الفيروسي وآليات الإمراض. ومع ذلك، فإن استخدام جميع مزايا استخدام الأجهزة العضوية عند استخدام الفيروسات شديدة الإمراض يمثل تحديا تقنيا ويتطلب اعتبارات صارمة للسلامة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، حيث غالبا ما تزرع الأعضاء في ثلاثة أبعاد ، فإن الجانب القاعدي من الخلايا يواجه الجزء الخارجي من الجهازي بينما يواجه جانبهم القردي الداخل (التجويف) للأعضاء. تشكل هذه المنظمة تحديا لمسببات الأمراض المعوية حيث يبدأ العديد من العدوى المعوية من الجانب apical / luminal من الخلايا بعد الابتلاع. ستقدم المخطوطة التالية بروتوكولا شاملا لإعداد الأعضاء المعوية البشرية للعدوى بمسببات الأمراض المعوية من خلال النظر في جانب العدوى (apical مقابل basolateral) لإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتوصيف التفاعلات المضيفة / الممرضة الخاصة بنوع الخلية. هذه الطريقة تفاصيل إعداد organoids فضلا عن الاعتبارات اللازمة لأداء هذا العمل في إطار مستوى السلامة البيولوجية 3 (BSL-3) ظروف الاحتواء.

Introduction

دراسة الروبيزم نوع الخلية الخاصة والاستجابة المناعية نوع الخلية محددة للفيروسات المعوية البشرية كانت صعبة تاريخيا بسبب عدم وجود نماذج الخلوية البشرية الأولية. وقد تم الآن القضاء على هذا القيد جزئيا مع تطوير organoids1. في حالة الجهاز الهضمي ، تم تطوير نماذج المعدة والجهاز العضوي المعوي للبشر والعديد من الأنواع الأخرى (على سبيل المثال ، مورين، البقرة ، القطط ، الخفافيش)2،3،4،5،6. الأجهزة المعوية استنساخ الهندسة المعمارية الهيكلية للظهارة المعوية البشرية وتحتوي على هياكل سرداب وزغب مثل، الأنساب المعوية وظيفية، وحتى تم استخدامها لتحديد أنساب الخلايا غير معروفة سابقا. يمكن استخدام نهجين مختلفين لزراعة الأجهزة العضوية المعوية. أولا، يتم عزل الخلايا الجذعية المعوية التي تحتوي على سرداب من استئصال الأنسجة أو الخزعات وتزرع في ظل ظروف ثقافية محددة (على سبيل المثال، Wnt3A، R-spondin، Noggin، وEGF) لتوسيع، ومن ثم التفريق بين الخلايا الجذعية لمعظم أنساب الخلايا المعوية (على سبيلالمثال، enterocytes، خلايا بانيث، خلايا غوبلت، خلايا الأمعاء)7. تسمح هذه الطريقة بعزل الأعضاء العضوية عن جميع أقسام الجهاز الهضمي(علىسبيل المثال ، المعدة ، الاثني عشر ، جيجونوم ، الإيليوم ، والقولون). تعتمد الطريقة الثانية على الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو الجنينية التي يسببها الإنسان ، والتي يتم تمييزها بعد ذلك في عملية تدريجية إلى خلايا ظهارية معوية8. غالبا ما توصف هذه الأجهزة العضوية المستحثة القائمة على الخلايا الجذعية بأنها ذات طبيعة جنينية أكثر مقارنة بالأعضاء المشتقة من المريض. في حين أن جميع هذه النماذج العضوية كانت حاسمة لكشف الإشارات التنموية اللازمة لتشكيل الجهاز المعوي ، فإن استخدامها في أبحاث الأمراض المعدية لا يزال في مهده.

الفيروس المعوي هو مصطلح واسع يغطي جميع الفيروسات ، والتي تصيب من خلال الجهاز الهضمي ، مثل فيروسات picorna(علىسبيل المثال ، EV – 71) ، الفيروسات الروفيروس (على سبيل المثال ، فيروس الروتا) ، والفيروسات الكلوية (على سبيل المثال ، نوروفيروس)9. تبدأ الفيروسات المعوية دورة حياتها المعدية من خلال تناول الطعام والماء الملوثين ، مما يجعل الناس في البلدان النامية معرضين لخطر كبير بسبب تصريف النفايات غير المعالجة في البيئة ونقص الرعاية الطبية بعد ظهور العدوى10. اعتمادا على نوع الممرض ، يمكن أن تؤدي العدوى إلى التهاب المعدة والأمعاء والقيء و / أو الإسهال المائي بسبب تسرب بطانة الأمعاء. الفيروسات النوروية البشرية هي مسببات الأمراض المعوية المنتشرة للغاية والمعدية للغاية ، التي تؤدي إلى أكثر من 600 مليون عدوى و 15 مليون دخول المستشفى في جميع أنحاء العالم11. وقد Organoids مفتاح البحوث نوروفيروس لأنها تدعم العدوى وتكرار نوروفيروس الإنسان، الذي كان سابقا غير قادر على أن تكون مثقفة في نماذج ثقافة الخلايا القياسية12.

على مدى العقدين الماضيين ، ظهرت الفيروسات التاجية كمسببات أمراض بشرية رئيسية13. وتشمل هذه الأسرة فيروس كورونا المسبب للأمراض الشديد، والسارس-CoV-1، والسارس-CoV-2، والتي تتطلب احتواء صارم على مستوى السلامة عند إجراء البحوث على هذه الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، في حين أن جميع هذه مسببات الأمراض الثلاثة معترف بها في الغالب لأعراضها التنفسية المستحثة وضيقها، فمن الواضح الآن أن هذه الفيروسات لا تصيب الجهاز التنفسي فقط ولكن أيضا الأعضاء الأخرى. علم أمراض مهم الناجمة عن مرض سارس-CoV-2 المرضى المصابين إلى جانب الضائقة التنفسية هو وجود أعراض الجهاز الهضمي14. يظهر على جزء صغير من المرضى المصابين بالسارس- كو فى-2 مثل هذه الأعراض، تتراوح بين الإسهال الخفيف جدا والإسهال الشديد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الكشف عن جينوم سارس-CoV-2 في خزعات البراز والجهاز الهضمي للمرضى المصابين15. ومن المهم ان وجود اعراض الجهاز المعوى لا يقتصر على السارس – فيروس كورونا – 2 كما لوحظ ايضا فى مرضى فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الاوسط التنفسية والسارس – فيروس الكوافير – 1 . لفهم كيف يسبب السارس-CoV-2 الضيق المعدي المعوي وتحديد بالضبط تروبية السارس-CoV-2 في الجهاز الهضمي، كانت الأجهزة المعوية البشرية أداة رئيسية ويتم استغلالها الآن لكشف الاستجابات الخاصة بنوع الخلية لهذا الممرض16،17.

التنميط النسخي لأعضاء الخلية (تسلسل الحمض النووي الريبي السائب) كان ممارسة معتادة عند تقييم العدوى المسببة للأمراض في كل من خطوط الخلايا الخالدة وكذلك مع الأجهزة العضوية. في حين أن هذا يسمح لنا بتحديد التغيرات العالمية استجابة لمسببات الأمراض (على سبيل المثال، رفع تنظيم السيتوكينات)، فإن الرناسيك السائب لا يسمح لنا بتحديد سبب كون خلايا محددة في السكان أكثر عرضة للعدوى من غيرها. أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) أداة قوية لكشف برامج النسخ الخاصة بالنسب الخلوي ويمكن استخدامه لتحديد كيفية دعم هذه البرامج أو قمع عدوى الفيروس18،19. وكان أول وصف scRNAseq في عام 2009 ، وكان يستخدم لتقييم ملامح النسخ من الخلايا المختلفة الموجودة في blastomere الماوس20. وقد تم الآن توسيع نطاق هذه التكنولوجيات ويمكن تنفيذها من خلال عدة منصات مختلفة. الإصدارات المبكرة من هذه التكنولوجيا تطبيق مضان تنشيط فرز الخلايا (FACS) لفصل الخلايا الفردية للتسلسل، والتي كانت تقتصر في كثير من الأحيان على لوحات 96-أو 384-جيدا، وبالتالي إعطاء 300 خلايا فردية لتحليل لكل عينة21. وقد تم الآن تطوير هذه الأساليب من خلال منصات تسلسل الخلية الواحدة ، والتي تستخدم جهاز microfluidic لتغليف خلايا واحدة في قطرات فردية مع الباركود الذي يحتوي على الخرز. تسمح هذه التقنية بالتقاط ما يصل إلى 10,000 خلية لكل حالة عينة.

الجمع بين تكنولوجيا organoids مع scRNAseq يسمح لنا لدراسة كيفية تأثير مسببات الأمراض المعوية في الجهاز الهضمي بطريقة محددة نوع الخلية. ومع ذلك، يلزم أخذ عدة اعتبارات تقنية واعتبارات السلامة الأحيائية. أولا وقبل كل شيء، أساليب ثقافة organoids الكلاسيكية (3 الأبعاد (3D) organoids، جزءا لا يتجزأ من مصفوفة خارج الخلية (ECM)) فضح الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية إلى خارج الجهاز. كما مسببات الأمراض المعوية بدء العدوى من خلال ابتلاع الطعام الملوث / الماء، والعدوى في معظم الأحيان يبدأ من الجانب apical من الخلايا، والتي لا يمكن الوصول إليها في هذه organoids المعوية 3D. لذلك ، يجب أن تكون الأعضاء مستعدة لجعل الجانب apical متاحا للعدوى الممرضة إما عن طريق البذر ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي تعريض الجانب apical للخلايا مباشرة ، أو من خلال التجميل الدقيق22،23. ثانيا، لإجراء scRNAseq من العينات البيولوجية المصابة، من المهم النظر في طبيعتها المعدية. في حين تم اقتراح طرق لإصلاح الخلايا وتعطيل مسببات الأمراض قبل عزل خلية واحدة لRNAseq اللاحقة، وهذه الأساليب غالبا ما تؤدي إلى انخفاض في نوعية التسلسل18. يصف البروتوكول أدناه عدة طرق لإصابة الأعضاء المعوية بالفيروسات المعوية بالنظر إلى جانب العدوى (العدوى القاعدية مقابل القاعدية)(الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، سيتضمن البروتوكول سير عمل لفصل وعزل الخلايا المفردة عن الأعضاء المصابة بالفيروسات شديدة الإمراض ل scRNAseq. وسيسلط البروتوكول الضوء على الخطوات الرئيسية التي يتعين تنفيذها عند العمل في ظل ظروف احتواء السلامة الأحيائية من المستوى 3 (BSL-3) لتجنب توليد الهباء الجوي والتلوث المحتمل.

Protocol

تم تلقي الأنسجة البشرية من استئصال القولون أو خزعات الإيليوم من مستشفى هايدلبرغ الجامعي للبروتوكول التالي. وقد أجريت هذه الدراسة بموجب توصيات المستشفى الجامعي هايدلبرغ بموافقة خطية مستنيرة من جميع المواضيع وفقا لإعلان هلسنكي. وقد تم استلام جميع العينات والاحتفاظ بها بطريقة مجهولة المصدر. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى هايدلبرغ الجامعي بموجب البروتوكول S-443/2017. 1. صيانة وتمرير الأجهزة المعوية والقولون تنبيه: تستمد الأعضاء المعوية البشرية من الأنسجة البشرية أو من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات/الجنينية، وعلى هذا النحو، يلزم الحصول على موافقة أخلاقية. وينبغي اتباع لوائح خاصة بكل بلد. المواد البشرية عموما لا يتم اختبارها، وبالتالي غالبا ما تعتبر مادة BSL-2. وينبغي تأكيد شروط الاحتواء السليمة في البلد الذي تجري فيه التجربة. إعداد الأجهزة المعوية والقولون من الأنسجة المعزولة و / أو الخزعات باستخدام الأساليب الموصوفة سابقا2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن العثور على مزيد من التفاصيل التقنية حول كيفية إعداد الأجهزة العضوية من المواد المشتقة من المريض أو من iPSCs في Lees et al. وماهيوآخرون. بمجرد إنشاء الثقافات العضوية ، اتبع روتين التقسيم الموصوف أدناه لإعداد الأجهزة العضوية لأداء العدوى بمسببات الأمراض المعوية. البذور 20-100 organoids في 50 ميكرولتر من محلول ECM 100٪ في 24-جيدا غير الأنسجة زراعة لوحات المعالجة. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو (الجدول 1) لكل بئر. تغيير وسائل الإعلام كل يومين عن طريق إزالة 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة وإضافة 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام نمو جديدة لكل بئر. قم بتدفئة الوسائط لدرجة حرارة الغرفة قبل تغيير الوسائط.تنبيه: وسائل الإعلام الباردة سوف تسييل محلول ECM التي تحتوي على organoids. مرور organoids مرة واحدة في الأسبوع عندما يبدأ الداخلية لتصبح مظلمة بسبب تراكم الخلايا الميتة. ويمكن الاطلاع على مثال على ذلك في الشكل 2. في يوم التقسيم، قم بإزالة محلول ECM من -20 درجة مئوية وذوبانه على الجليد. ضع لوحة ثقافة الخلية الفارغة الجديدة التي سيتم استخدامها لزرع الأعضاء بعد تقسيمها عند 37 درجة مئوية (وهذا يتطلب حدا أدنى من 1 ساعة لتكون دافئة ويمكن تسخينها بين عشية وضحاها). قم بتدفئة وسائط الثقافة لدرجة حرارة الغرفة. إزالة وسائل الإعلام النمو مع ماصة P1000 وإضافة 500 ميكرولتر من الملحية الباردة 1x الفوسفات العازلة (PBS) إلى كل بئر لمدة 3 دقائق لتسييل جزئيا محلول ECM وينأى عن لوحة. لضمان التعطيل الكامل لمحلول ECM، استخدم ماصة P1000 (إعداد 450 ميكرولتر). ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لإعادة إنفاق برنامج تلفزيوني، حل ECM، و organoids، ونقل organoids resuspended في أنبوب مخروطي 15 مل ووضعها على الجليد. جمع آبار متعددة من نفس organoids في نفس الأنبوب المخروطي. إذا تم تقسيم العديد من الأجهزة العضوية المختلفة (متبرعين مختلفين ، أقسام مختلفة ، علاج مسبق مختلف ، وما إلى ذلك) في نفس الوقت ، فجمعها في أنابيب مخروطية مختلفة. أثناء جمع، والحفاظ على أنابيب مخروطية على الجليد. تدور العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة بعناية برنامج تلفزيوني مع ماصة للحفاظ على بيليه organoid في الجزء السفلي. تجنب استخدام نظام النفايات فراغ مع ماصة المجهزة كما بيليه organoids فضفاضة جدا ويمكن بسهولة يستنشق عند إزالة برنامج تلفزيوني بسرعة كبيرة جدا. إضافة 1 مل من 0.05٪ تريبسين إلى أنبوب مخروطي و organoids resuspend عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة P1000. احتضان أنبوب مخروطي يحتوي على organoids في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. إضافة 2 مل من وسائل الإعلام DMEM/F12 تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقدية لوقف الهضم وإعادة الإنفاق لتعطيل organoids عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة P1000. تدور العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة أنابيب مخروطية من الطرد المركزي وتخزينها على الجليد. إزالة وسائل الإعلام بعناية / تريبسين مع ماصة 5 مل المتاح للحفاظ على بيليه organoid في الجزء السفلي. ترك حوالي 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام وإزالة هذا مع ماصة P1000. مرة واحدة وقد تمت إزالة وسائل الإعلام / تريبسين من جميع الأنابيب المخروطية، وإزالة 24 جيدا غير الخلية الثقافة تعامل لوحة من حاضنة 37 درجة مئوية ووضعه تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. إضافة 100٪ حل ECM (أبقى على الجليد) إلى أنبوب مخروطي مع organoids الانقسام في 1:3 إلى 1:5 نسبة اعتمادا على عادات النمو من الأعضاء المانحة الفردية. (على سبيل المثال، إذا تم تمرير بئر واحد يحتوي على 20-100 عضو في قطرة 50 ميكرولتر من محلول ECM، أعيد إنفاق بيليه الجهازي إلى 150-250 ميكرولتر من محلول ECM البارد الجليدي).) البذور 50 ميكرولتر من محلول ECM / مزيج organoid لكل بئر من 24 جيدا غير الخلية الثقافة تعامل لوحة قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية.ملاحظة: سوف حل ECM يبوليمر بسرعة كبيرة بمجرد أن يكون قد ارتفعت درجة حرارتها. حافظ على برودة محلول ECM في جميع الأوقات (المخزنة على الجليد) أثناء الاستخدام. عندما يتم إعادة إنفاق الأجهزة العضوية ، قم بزرعها على الفور على طبق جديد. للمبتدئين، فمن المستحسن لتخزين مربع من نصائح ماصة في -20 درجة مئوية للسماح بوقت إضافي للبذر. احتضان لوحة 24 بئرا في 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة للسماح للحل ECM لبوليمرة. بعد البلمرة، إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو (الجدول 1)26 إلى كل بئر واحتضان organoids في 37 درجة مئوية. تحقق من organoids يوميا عن طريق المجهر. تغيير الوسائط كل يومين كما في الخطوة 1.4. 2. إعداد organoids في بعدين (2D) للعدوى apical ملاحظة: يصف البروتوكول التالي كيفية زرع الأعضاء المعوية كطبقة أحادية من الخلايا في لوحة ثقافة الخلية لتصيب خلايا الظهارة المعوية من جانبها apical. استخدم لوحة 48 جيدا لتجارب التسلسل وشريحة الغرفة ذات القاع الزجاجي ذات 8 آبار للسيطرة على العدوى باستخدام نهج الفلورسينس المناعي. تنمو والحفاظ على organoids كما هو موضح في القسم 1. قبل بذر الأجهزة العضوية في 2D، معطف لوحات 48 جيدا و8-جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة مع 200 ميكروغرام من الكولاجين البشري 2.5٪ في الماء لكل بئر لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.ملاحظة: أفضل الأجهزة العضوية المعوية المصنفة في لوحات 48 جيدا وفي 8-جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة. وقد أظهرت التجربة أنها لا تصيب بشكل جيد في لوحات 96 بئرا. يمكن أيضا استخدام إدراج ترانسويل للسماح لكل من العدوى apical و basolateral في 2D. إذا تم استخدام إعادة الانتفاخات، فراقب المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER) قبل الإصابة لتأكيد وجود طبقة أحادية التقاء. عادة، الأجهزة المعوية لديها حاجز ضيق مع TEER من 450-600 أوم / سم2. البذور 100-150 organoids في كل بئر من لوحة 48 جيدا أو بئر واحد من 8 جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة. لتقدير عدد الأجهزة العضوية، عد عدد الأجهزة العضوية الموجودة في 50 ميكرولتر من إسقاط محلول ECM من لوحة 24 جيدا المعدة في القسم 1. في المتوسط، هناك حاجة إلى 1-2 الآبار، والتي سوف تعطي ما يقرب من 15،000-30،000 الخلايا. لتعطيل حل ECM ومحاولة إضفاء الطابع العضوي، اتبع الخطوات 1.8-1.17. إزالة الكولاجين البشري من لوحات 48 جيدا و8 جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة. Resuspend بيليه organoid في أنبوب مخروطي في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو / جيدا وإضافة الخليط إلى الآبار المغلفة بالكولاجين. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.ملاحظة: عند إجراء التجارب، تتم مقارنة حالات متعددة (وهمية مقابل المصابين +/- علاج الفائدة). لتقليل التباين بين كل بئر من الأعضاء العضوية ذات البذور 2D ، قم بجمع العدد الإجمالي للأعضاء الضرورية في نفس الأنبوب المخروطي. جمع organoids من ما يصل إلى 12 بئرا من لوحة 24 بئرا يمكن استخدام 1 مل من التريبسين و 2 مل من وسائل الإعلام تحييد. عند استخدام 12-24 بئرا، قم بزيادة هذا إلى 2 مل من التريبسين و4 مل من وسائل الإعلام المحايدة. بعد 48 ساعة، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية. إزالة وسائل الإعلام النمو واستبداله مع 250 ميكرولتر لكل بئر من وسائل الإعلام التمايز (الجدول 1). كرر هذا التغيير وسائل الإعلام 48 ساعة في وقت لاحق. بعد 48 ساعة، تأكد من التمايز (أربعة أيام بعد التبديل إلى وسائط التمايز) عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي، مما يجعل cDNA مع 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي، وأداء SYBR الأخضر القائم على qPCR باستخدام التمهيديات للخلايا الجذعية (OLFM4 و / أو SMOC2)، والخلايا الكؤوس (MUC2)، وخلايا الغدد الصماء المعوية (CHGA)، والخلايا المعوية (SI و / أو CYP3A4)(الشكل 3).ملاحظة: عند التحول من وسائط النمو إلى وسائط التمايز، سوف تقلل الأجهزة العضوية من تعبيرها عن علامات الخلايا الجذعية (OLFM4 و/أو SMOC2) وتزيد من التعبير عن الخلايا الطرية (MUC2) وخلايا الغدد الصماء المعوية (CHGA) وعلامات الخلايا المعوية (SI و/أو CYP3A4) بواسطة qPCR. إعداد بئر إضافية والحفاظ مع وسائل الإعلام النمو لمقارنة مستوى التعبير من كل علامة نوع الخلية الخاصة في النمو مقابل وسائل الإعلام التمايز. عند تأكيد التمايز ، تكون الأعضاء جاهزة للعدوى العضية. نقل organoids إلى مستوى السلامة الحيوية احتواء المطلوبة لمسببات الأمراض في الاختيار.تنبيه: راجع اللوائح المحلية للمعهد وإجراءات التشغيل القياسية عند التعامل مع مسببات الأمراض تحت احتواء BSL-2 أو BSL-3. لإصابة الأجهزة العضوية المعوية التي تزرع في 2D من جانبها apical، وإزالة وسائل الإعلام مع ماصة P1000 وإضافة مسببات الأمراض المخففة في تعدد العدوى المطلوبة للتجربة في وسائل الإعلام التمايز (الحد الأدنى لحجم الممرض / مزيج وسائل الإعلام هو 50 ميكرولتر لكل بئر والحد الأقصى لحجم هو 250 ميكروغرام لكل بئر). السماح للعدوى المضي قدما لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية مع إما طاولة الروك تقع في حاضنة ثقافة الخلية أو عن طريق هزاز يدويا لوحة كل 15-20 دقيقة. تحسين هذه المرة على أساس الممرض من اختيار. بعد 2 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام مع ماصة P1000 واستبداله مع 250 ميكرولتر لكل بئر من وسائل الإعلام التمايز الطازجة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى النقطة الزمنية لتسلسل الخلية الواحدة. لإعداد خلايا لتسلسل الخلية المفردة، انتقل إلى القسم 4. 3. إعداد organoids في ثلاثة أبعاد (3D) للعدوى apical و basolateral تنمو organoids كما هو موضح في القسم 1 في 24 جيدا، غير الخلية الثقافة لوحة المعالجة. يومين بعد التمرير، وإزالة لوحة من الحاضنة ومكان في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. إزالة وسائل الإعلام مع نمو ماصة P1000، واستبداله مع 500 ميكرولتر / بئر من وسائل الإعلام التمايز مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة، استبدال وسائط التمايز جديدة (500 ميكرولتر / جيد).ملاحظة: يتم الاحتفاظ Organoids في وسائل الإعلام التمايز لما مجموعه 4 أيام قبل الإصابة. تأكيد التمايز كما هو موضح في الخطوة 2.9. عند التأكيد على حدوث التمايز ، تكون الأعضاء جاهزة للعدوى. تذوب ECM على الجليد. قم بتدفئة وسائط التمايز لدرجة حرارة الغرفة وتدفئة طبق من 24 بئرا عند 37 درجة مئوية. لإجراء الالتهابات، قم بإزالة الأجهزة العضوية من محلول ECM.ملاحظة: إزالة أكبر قدر ممكن من حل ECM كما تفضل الفيروسات التمسك حل ECM بدلا من الخلايا. إذا كان هناك الكثير من محلول ECM المتبقي حول organoids ، فستتأثر العدوى بشدة. تعطيل ECM بإضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x الباردة واحتضان لمدة 3 دقائق. استخدام P1000 إلى ماصة صعودا وهبوطا 10x. الجمع بين organoids في أنبوب وجهاز الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة برنامج تلفزيوني مع P1000.ملاحظة: لتقليل التباين بين كل حالة عدوى، اجمع بين الأجهزة العضوية القادمة من عدة آبار من لوحة من 24 بئرا في نفس الأنبوب المخروطي. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى ثمانية شروط للعدوى، سيتم دمج ثمانية آبار من لوحة من 24 بئرا (تحتوي على ~100 عضو لكل منها) وتقسيمها لاحقا إلى ثماني آبار من لوحة جديدة من 24 بئرا بعد تعطيل الإبر (انظر الخطوة 3.12). Resuspend organoids في 1 مل من وسائل الإعلام التمايز. بالنسبة للعدوى القاعدية والباسولاتيرال اتبع الخطوة 3.10.1 وللإصابة القاعدية فقط اتبع الخطوة 3.10.2. إرفاق إبرة 27 G إلى حقنة 1 مل وإعادة تثبيت بيليه ست مرات للسماح بتعطيل organoids والعدوى أن تحدث في كل من الجانبين apical وbasolateral. انتقل إلى الخطوة 3.11.ملاحظة: يجب أن تكون الأجهزة العضوية هي الأجهزة الكلاسيكية ذات المظهر الكيسي والأخطبوط الناشئة مع مركز مظلم عند ملاحظتها قبل تعطيل الإبرة. بعد التعطيل ، ستظهر هذه الأعضاء أصغر مع أقل من أي داخلي مظلم. عند إجراء العدوى ، سيكون هناك دائما شرطان على الأقل (وهمية والعدوى) ، وسيتم الجمع بين بئرين على الأقل من لوحة 24 بئرا في البداية في أنبوب مخروطي 15 مل لتعطيل القائم على إبرة (مما يفسر لماذا يتم استخدام ما لا يقل عن 1 مل لإعادة الإنفاق). عند أداء أكثر من شرطين، الجمع بين ما يصل إلى 10 آبار من لوحة 24 جيدا في أنبوب واحد مخروطي 15 مل وإعادة الإنفاق في 1 مل من وسائل الإعلام التمايز لتعطيل إبرة. بعد التعطيل، أضف 500 ميكرولتر من وسائط التمايز لكل n + 1 (على سبيل المثال، إذا كنت تستخدم 10 آبار، ثم قم بإضافة 4.5 مل إلى إجمالي 5.5 مل). إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من 10 شروط، استخدم عدة أنابيب مخروطية. يوصى بحقنة 1 مل حيث يتم تعطيل الأجهزة العضوية بشكل أفضل مع هذا الحجم من الحقنة. بديل للمحاقن هو استخدام طرف P1000 بالارض بشكل جيد. Resuspend organoids في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التمايز في بئر. يجب الحرص على عدم تعطيل organoids وتأكد من أن الجانب apical لا يمكن الوصول إليها. انتقل إلى الخطوة 3.11. نقل 500 ميكرولتر من تعليق organoid لكل بئر إلى لوحة ثقافة الخلية 24 جيدا باستخدام ماصة P1000 ونقل لوحة إلى مستوى السلامة الحيوية احتواء المطلوبة لمسببات الأمراض في الاختيار.تنبيه: راجع اللوائح المحلية وإجراءات التشغيل القياسية للمعهد عند التعامل مع مسببات الأمراض تحت احتواء BSL-2 أو BSL-3. دائما إجراء تعطيل إبرة من organoids خارج BSL-3 لتجنب الحوادث المحتملة مع الإبرة. قد تمنع اللوائح المحلية أيضا استخدام الإبر في BSL-3. إضافة الممرض المخفف في وسائط التمايز للوصول إلى تعدد العدوى المطلوبة للتجربة. لا تتجاوز الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر (أن يكون إجمالي 1 مل في لوحة 24 بئر). السماح للعدوى المضي قدما لمدة 2 ساعة (هذه المرة سوف تحتاج إلى تكييفها مع مسببات الأمراض في الاختيار) في 37 درجة مئوية مع إما طاولة الروك الموجودة في حاضنة ثقافة الخلية أو عن طريق هزاز يدويا لوحة كل 15-20 دقيقة. بعد حضانة 2 ساعة، وجمع organoids في أنبوب واحد 1.5 مل لكل حالة وتدور في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة الوسائط التي تحتوي على مسببات الأمراض مع ماصة P1000 وتخزينها على الجليد. غسل بيليه organoids مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. Resuspend organoids في 50 ميكرولتر من محلول ECM 100 ٪ (الذي كان يذوب سابقا على الجليد) ، لوحة في 24 جيدا غير الخلية ثقافة معالجة لوحة ساخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية واحتضان لوحة 24 جيدا في 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة للسماح للحل ECM لبوليمرة. بعد البلمرة، أضف 500 ميكرولتر من وسائط التمايز في درجة حرارة الغرفة لكل بئر واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى الحصاد لتسلسل الخلية الواحدة.ملاحظة: إذا كان الحصاد يحتاج إلى أن يحدث أكثر من 48 ساعة بعد البذر، قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق إزالة الوسائط القديمة واستبدالها ب 500 ميكرولتر من وسائط التمايز الطازجة. ومع ذلك ، فقد أظهرت التجربة أنه نظرا لأن organoids تزرع تحت وسائل الإعلام التمايز ، فإنها لن البقاء على قيد الحياة لفترة أطول بكثير من 48 ساعة. 4. إعداد حل خلية واحدة وإعداد هلام الخرز في مستحلب (GEMs) في مستوى السلامة البيولوجية 3 (BSL-3) الشروط ملاحظة: يتطلب إكمال الخطوات التالية وجود معدات تسلسل الخلية الواحدة(جدول المواد)وآلة PCR القادرة على التعامل مع تفاعلات 100 ميكرولتر داخل منشأة BSL-3. تزرع الأجهزة العضوية كما هو موضح في القسم 1 وتصاب كما هو موضح في الأقسام 2-3 اعتمادا على مسببات الأمراض ومسار الدخول. في وقت محدد مسبقا بعد العدوى ، يتم حصاد الأجهزة العضوية. فيما يلي وصف للطريقة المستخدمة لحصاد الأجهزة العضوية المعوية. قبل حصاد الأجهزة العضوية المصابة، قم بإزالة حبات جل الخلية الواحدة(جدول المواد)من -80 درجة مئوية ودافئة إلى درجة حرارة الغرفة (قبل 30 دقيقة على الأقل). بالإضافة إلى ذلك، قم بتوازن كاشف RT، وتقليل العامل B وانزيم RT C (وكلها مخزنة عند -20 درجة مئوية) إلى درجة حرارة الغرفة. Resuspend قالب التبديل oligo كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة.ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية فيما يتعلق باللوائح المحلية للسلامة البيولوجية بعد إجراء التشغيل القياسي المعمول به لمسبب الأمراض المدروس. وكقاعدة عامة للعمل BSL-3، يجب التأكد من أن السطح الخارجي لجميع السفن (لوحات، أنابيب، الخ) الخروج من غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية يتم تطهيرها بشكل صحيح. وينطبق الشيء نفسه على أيدي / قفازات الشخص الذي يقوم بالتجارب. لإجراء العدوى على organoids المصنفة في 2D (القسم 2) المضي قدما إلى الخطوة 4.4. لإجراء العدوى على organoids 3D (القسم 3) انتقل إلى الأقسام 4.5. لالتهابات organoids 2D، وجلب لوحة ثقافة الخلية في غطاء محرك السيارة وإزالة وسائل الإعلام التمايز مع ماصة P1000. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x في درجة حرارة الغرفة إلى كل بئر. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة P1000 وإضافة 250 ميكرولتر من إنزيم تفكك درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، TrypLE اكسبرس) إلى كل بئر من لوحة 48 جيدا. تغيير القفازات، وتنظيف لوحة، ووضع لوحة مع انزيم الفصام في حاضنة 37 درجة مئوية. مراقبة تفكك الخلية عن طريق المجهر كل 5 دقائق.ملاحظة: تقريبا، فإنه يأخذ 15 دقيقة لتفكيك الأجهزة المعوية المستزرعة في 2D في خلايا واحدة. هذه المرة سوف تحتاج إلى تعديل لأنها سوف تعتمد على عدد الأجهزة التي تم زرعها في البداية والمصابين وكذلك على مسببات الأمراض وبعض مسببات الأمراض هي أكثر الأمراض الخلوية وتسبب organociate أسرع بكثير من غيرها. بعد تأكيد تعليق خلية واحدة واضحة، وجلب لوحة مرة أخرى إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية ووقف الهضم عن طريق إضافة 250 ميكروغرام من وسائل الإعلام DMEM/F12 تحتوي على 10٪ FBS لكل بئر من لوحة 48 جيدا. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة P1000. تغيير القفازات، وتنظيف الأنبوب، وتدور العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة بعناية وسائل الإعلام / انزيم الفصام مع P1000 للحفاظ على بيليه الخلية في الجزء السفلي. إعادة إنفاق خلايا مفردة في الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. بالنسبة للأعضاء المعوية ، أعيد الإنفاق في 250 ميكرولتر لكل بئر من اللوحة ذات ال 48 بئرا. تمرير تعليق الخلية في أنبوب FACS مع مرشح لإزالة أي كتل كبيرة ووضع أنبوب FACS التي تحتوي على خلايا على الجليد. انتقل إلى الخطوة 4.6 لمواصلة عد الخلايا وإعداد المزيج الرئيسي. بالنسبة لالتهابات الأعضاء ثلاثية الأبعاد ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك السيارة لثقافة الخلية. إزالة الوسائط التمايز من كل بئر من لوحة 24 جيدا مع ماصة P1000. إضافة 500 ميكرولتر من الجليد الباردة 1x برنامج تلفزيوني إلى كل بئر واحتضان لمدة 3 دقائق على الجليد. لضمان تعطيل كامل لمحلول ECM، استخدم ماصة P1000 (تعيين إلى 450 ميكرولتر). ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لإعادة إنفاق برنامج تلفزيوني, ECM الحل والأعضاء; نقل organoids resuspended في أنبوب مخروطي 15 مل ومكان على الجليد. جمع كل حالة العدوى في أنبوب مخروطي 15 مل الخاصة بها.ملاحظة: استخدام أنبوب مخروطي 15 مل يعطي أفضل, بيليه الخلية أكثر تميزا من أنبوب مخروطي 50 مل أو أنبوب 1.5 مل. تغيير القفازات وإزالة الأنبوب من غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. تنظيف الجزء الخارجي من الأنبوب. تدور العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. نقل أنبوب العودة إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية وإزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة P1000 لتجنب إعادة تعليق بيليه organoids من الجزء السفلي من الأنبوب. Resuspend بيليه في 1 مل من انزيم الفصام (على سبيل المثال، تريبل اكسبرس). تغيير القفازات وتنظيف الأنبوب واحتضان العينات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. كل 10 دقيقة لمدة 30 دقيقة، نقل أنبوب مرة أخرى في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية وإعادة إنفاق organoids عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 10 مرات.ملاحظة: عادة، تتطلب الأجهزة العضوية المعوية حوالي 30 دقيقة لتشكيل تعليق خلية واحدة عند إصابتها في 3D. لتحديد متى يتم فصل organoids إلى خلايا واحدة، واتخاذ 10 ميكرولتر من تعليق organoid باستخدام ماصة p10. ضع التعليق في شريحة عداد الخلايا البلاستيكية القابلة للتصرف. ختم منفذ إدخال العينة بشريط واضح. تغيير القفازات وتنظيف خارج عداد الخلية. استخدم مجهرا مشرقا لتحديد ما إذا كان يتم تعليق خلية واحدة. بعد تأكيد تعليق خلية واحدة، وقف الهضم عن طريق إضافة 1 مل من وسائط DMEM/F12 التي تحتوي على 10٪ FBS وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة P1000. تغيير القفازات، وتنظيف الأنبوب، وتدور العينات في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة بعناية وسائل الإعلام / انزيم الفصام مع ماصة P1000 لتجنب إعادة تعليق بيليه الخلية من الجزء السفلي من الأنبوب. إعادة إنفاق الخلايا المفردة في الحد الأدنى من حجم برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. للأعضاء المعوية resuspend في 250 ميكرولتر. تمرير تعليق الخلية في أنبوب FACS مع مرشح لإزالة أي كتل كبيرة ووضع أنبوب FACS التي تحتوي على خلايا على الجليد. انتقل إلى الخطوة 4.6 لمواصلة عد الخلايا وإعداد المزيج الرئيسي. تحديد عدد الخلايا لكل ميكرولتر بإضافة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى غرفة عد الخلايا البلاستيكية القابلة للتصرف. ختم منفذ إدخال العينة مع الشريط واضحة قبل إزالة العينة من غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، كما هو الحال في هذه المرحلة، تعليق الخلية لا تزال المعدية. تغيير القفازات، وتنظيف غرفة عد الخلايا، وحساب عدد الخلايا باستخدام المجهر brightfield. داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وإعداد مزيج رئيسي من كاشف RT، قالب التبديل أوليغو، والحد من عامل B، وRT إنزيم C في أنبوب 1.5 مل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة اعتمادا على عدد العينات في التجربة. لكل عينة، aliquot 33.4 ميكرولتر من مزيج رئيسي في أنبوب PCR وتخزينها على الجليد. إضافة الخلايا والماء إلى المزيج الرئيسي وفقا لرقم الخلية المستهدفة كما هو موضح في إرشادات الشركة المصنعة.ملاحظة: عادة ما يتم استرداد 50٪ -60٪ من الخلايا (أي عند تحميل 10000 خلية على الشريحة، يتم استخدام 5000-6000 خلية للتحليل). لذلك، قم بتحميل 10,000 خلية دوما. إذا لم تسمح كثافة الخلية بذلك، فطرد الخلايا وإعادة إنفاقها في حجم أقل. الحرص على عدم إثقال كاهل رقاقة لأن هذا سيؤدي إلى انسداد رقاقة. بالإضافة إلى ذلك، إذا لم يتم فصل الخلايا بشكل صحيح، سيكون هناك خطر متزايد من الحصول على خلايا متعددة لكل حبة، والتي سوف تحتاج إلى إزالتها في معالجة المعلوماتية الحيوية المصب. تغيير القفازات، ونقل وحدة تحكم خلية واحدة في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية، وإعداد رقاقة كما يتم تغطية رقاقة فقط مع طوقا التي لم يتم مختومة.ملاحظة: يجب أن يكون الجهاز داخل غطاء محرك السيارة لمنع التعرض لتعليقات الخلايا المصابة والهباء الجوي المحتمل. إضافة رقاقة خلية واحدة إلى حامل رقاقة وملء الممرات غير المستخدمة مع 50٪ الجلسرين. إضافة المزيج الرئيسي والخرز، وتقسيم النفط إلى الممرات المستخدمة لعينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تغطية رقاقة مع طوقا، تحميل رقاقة في وحدة تحكم، وبدء البرنامج.ملاحظة: يوصى بتحميل ستة ممرات فقط من الممرات الثمانية. غالبا ما تحدث مشكلات مع المستحلبات غير السليمة في الممرين الأول والثامن. وتقول الشركة إن جميع الممرات مستقلة، وهذا لا ينبغي أن يحدث؛ ومع ذلك، إذا كان ذلك ممكنا، وتجنب هذه الممرات اثنين وتشغيل اثنين من رقائق إذا كانت هناك حاجة إلى ثماني عينات. عند الانتهاء من البرنامج، قم بإزالة الشريحة والحشايا. استخدام ماصة متعددة القنوات ونقل 100 ميكرولتر من المستحلبات إلى أنبوب PCR نظيفة. تأكد من أن كل بئر له لون أبيض موحد يشير إلى حدوث مستحلب كامل. تغيير القفازات وتنظيف الأنابيب ونقل أنبوب PCR إلى جهاز PCR يمكنه دعم تفاعلات 100 ميكرولتر. تشغيل البرنامج: 53 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة؛ 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. عند الانتهاء، قم بتخزين العينات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. عند هذه النقطة، معالجة رد الفعل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو تخزين في 4 درجة مئوية لمدة 3 أيام أو -20 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع. بعد 5 دقائق عند 85 درجة مئوية، سيتم تعطيل معظم الفيروسات المغلفة، وإزالة cDNA من BSL-3 وفقا لإجراء التشغيل العادي وإجراء الاستعدادات المكتبة في مختبر BSL-1.ملاحظة: يجب إجراء هذه التجربة كثلاث نسخ بيولوجية متماثلة (على سبيل المثال، في ثلاثة أيام مختلفة) لأن مدى التمايز بين كل نوع من أنواع الخلايا يمكن أن يختلف قليلا بين كل تجربة. يمكن فهرسة مكتبات التسلسل الناتجة وتسلسلها معا بشكل مختلف في تشغيل تسلسل واحد.

Representative Results

إعداد الأجهزة العضوية لتسلسل الخلية الواحدةتعتمد نتائج تسلسل الخلية الواحدة بشكل كبير على استخدام خلايا ذات نوعية جيدة. لضمان أن الأجهزة العضوية ذات نوعية جيدة ، يجب الحفاظ عليها ومراقبتها بشكل صحيح على أساس يومي لتحديد متى تكون جاهزة للانقسام(الشكل 2). ويعتمد توقيت تقسيم الأعضاء العضوية على المانحين؛ بعض المانحين تنمو بسرعة أكبر وتحتاج إلى تقسيم كل 5 أيام، في حين أن البعض الآخر أبطأ وتحتاج إلى تقسيم كل 10 أيام. في المتوسط ، يتم تقسيم organoids مرة واحدة في الأسبوع عندما تصبح المراكز مظلمة (الشكل 2B). إذا سمح للعضيات أن تصبح كبيرة جدا وتتراكم الكثير من الخلايا الميتة في المركز ، فإن الجهازي سيموت. يتم الاحتفاظ Organoids في وسائل الإعلام التي تحتوي على كميات عالية من Wnt3A. وهذا يدعم مكانة الخلايا الجذعية ويعزز organoids لمواصلة النمو والانتشار. في ظل ظروف النمو هذه ، تحتوي الأجهزة العضوية على كميات عالية من الخلايا الجذعية والخلايا المضخمة للعبور وكمية أقل من مجموعات الخلايا المتمايزة مثل الخلايا المعوية الناضجة وخلايا Goblet وخلايا الغدد الصماء المعوية. ومع ذلك ، لمحاكاة التعقيد الخلوي الموجود داخل الأمعاء البشرية ، من المهم دفع تمايز الخلايا وإنتاج المزيد من هذه الخلايا. ويتم ذلك عن طريق تغيير ظروف وسائل الإعلام وإزالة Wnt3A، والحد من R-Spondin و Noggin (الجدول 1). عادة، التمايز الخلوي نحو enterocytes، خلايا الكؤوس، وخلايا الغدد الصماء المعوية يتطلب 4 أيام من وسائل الإعلام التمايز(الشكل 3). ومن المهم الحصول على تمييز جيد؛ وإلا، فإن تقييم التروبينية الممرضة والاستجابات الخاصة بنوع الخلية سيصبح صعبا. تأكيد تعطيل مسببات الأمراض BSL-3يجب التأكد من تعطيل كامل مع الممرض من اختيار والتحقق من أنه من الآمن لإزالة cDNA من BSL-3. وبالنسبة لفيروس سارس-كو-2، تم التحقق من ممارسة الحفز الكامل للفيروس عن طريق تناول 100 ميكرولتر من السارس-كوف-2 واحتضانه في جهاز PCR لمدة 5 دقائق عند 85 درجة مئوية. ثم تمت إضافة الفيروس مرة أخرى إلى خلايا فيرو السذاجة، وقورنت عدوى الفيروس بالفيروس غير المعالج بالحرارة عن طريق الفتور المناعي ومقايسات البلاك عند 24 ساعة و48 ساعة و72 ساعة بعد العدوى لضمان أن جميع الجسيمات لم تعد معدية. وأرسلت هذه النتائج إلى الوكالة التنظيمية المحلية، وعند الموافقة عليها أجريت تجربة الخلية الواحدة وتجهيز الخلايا المغلقة. نتائج تسلسل الخلية الواحدةولتقييم كيفية إصابة سارس-كوف-2 للقولون البشري والأعضاء الايليومية، تم إجراء تسلسل وحيد الخلية. تم إعداد الأجهزة العضوية كما هو موضح أعلاه والمصابين في شكل 2D للسماح للعدوى apical من قبل سارس-CoV-2. تم حصاد الخلايا المصابة في 12 ساعة و 24 ساعة بعد العدوى، وتم تجهيزها لتسلسل خلية واحدة على النحو المبين أعلاه. تحليل بيانات تسلسل الخلية الواحدة سمح لنا لتحديد أن السكان الفرعيين فقط (enterocyte غير ناضجة 2) من الخلايا الظهارية المعوية البشرية تدعم عدوى سارس-CoV-2(الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، بما أنه لم يتم إصابة جميع الخلايا في السكان، فقد تم تحليل كل من الخلايا المصابة وخلايا المارة غير المصابة(الشكل 5). وأظهرت هذه النتائج أن السارس-CoV-2 تسبب في سلسلة إشارات مؤيدة للالتهابات في الخلايا المصابة في حين أظهرت خلايا المارة غير المصابة استجابة مناعية بوساطة الإنترفيرون. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت scRNA-Seq أن الخلايا المصابة لم تتمكن من استشعار الإنترفيرونات بسبب انسداد المسار بوساطة الفيروس(الشكل 5). لم يكن من الممكن الحصول على هذه المعلومات عند استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي السائب. الشكل 1:تخطيطي يصور الطرق الثلاث المختلفة لإعداد الأعضاء المعوية البشرية للعدوى مع مسببات الأمراض المعوية. يمكن تحقيق العدوى Apical من خلال بذر الأجهزة المعوية في 2D. يمكن إجراء عدوى apical و basolateral عن طريق تعطيل الجهاز ثلاثي الأبعاد. وأخيرا، يمكن إجراء عدوى البازلات فقط عن طريق إصابة الأجهزة العضوية المعوية ثلاثية الأبعاد سليمة. يمكن استخدام كل من هذه الطرق لإنشاء عينات لتسلسل خلية واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: صيانة Organoid التخطيطي وصور brightfield تمثيلية. (أ) التخطيطي لصيانة وتمرير الأجهزة العضوية المعوية البشرية. (ب). صور brightfield ممثل من الأيام 1 و 3 و 5 و 7 بعد تقسيم. بحلول اليوم 7 تصبح organoids كبيرة ومظلمة بسبب تراكم الخلايا الميتة وعلى استعداد لتقسيم. يشير شريط المقياس إلى 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: ممثل qPCR من organoids الأمعاء البشرية 4 أيام بعد التحول إلى وسائل الإعلام التمايز. تم الحفاظ على الأجهزة العضوية المعوية في وسائل الإعلام النمو أو تحولت إلى وسائل الإعلام التمايز لمدة 4 أيام. تم حصاد الحمض النووي الريبي وتم إجراء qPCR لعلامات الخلايا الجذعية (OLFM4) وخلايا بانيث (LYZ) وخلايا العكارة (MUC2) والخلايا المعوية (SI). N = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تحديد عدد الخلايا المصابة بالسارس – فيروس الكواز – 2 . وقد اصيب الاعضاء المشتقة من القولون والايليوم بالسارس – كو فى – 2 . وبعد حصاد 12 و24 ساعة من خلايا ما بعد العدوى وإخضاعها لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد مجموعات الخلايا التي تدعم عدوى السارس-CoV-2. تم العثور على عدوى الفيروس لزيادة مع مرور الوقت وتصيب أساسا enterocyte غير ناضجة 2. وقد تم تعديل هذا الرقم منتريانا وآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5:تحديد الاستجابة المناعية الفطرية الجوهرية. وقد اصيبت الاعضاء المشتقة من القولون البشرى بالسارس – كوف – 2 . بعد 12 و 24 ح بعد العدوى تم حصاد الخلايا وتخضع لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة لتحديد الاستجابة المناعية الفطرية الجوهرية في كل من الخلايا المارة المصابة فيروسيا وغير المصابة. وقد أظهرت الخلايا المصابة بالسارس-CoV-2 استجابة قوية مؤيدة للالتهابات في حين أظهرت خلايا المارة غير المصابة استجابة بوساطة الإنترفيرون. الرقم المعدل من ترياناوآخرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. وسائل الإعلام النمو مركب التركيز النهائي إعلان DMEM/F12 الغلوتاماكس (1X) +الغلوتاماكس HEPES 1 مليون متر +هيبس القلم 10 U/mL +P/S بكتيريا 10 ميكروغرام/مل L-WRN 50٪ من حيث الحجم B27 01:50 ن-أسيتيل-سيستين 1 مليون متر منتدى إدارة الإنترنت 50 نانوغرام/مل A83-01 500 مليون متر منتدى إدارة الإنترنت-1 100 نانوغرام/مل FGF الأساسية 50 نانوغرام/مل جاسترين 10 مليون متر وسائل الإعلام التمايز مركب التركيز النهائي إعلان DMEM/F12 الغلوتاماكس (1x) +الغلوتاماكس HEPES 1 مليون متر +هيبس القلم 10 U/mL +P/S بكتيريا 10 ميكروغرام/مل B27 01:50 ن-أسيتيل-سيستين 1 مليون متر آر بوندين 5٪ من حيث الحجم راس 50 نانوغرام/مل منتدى إدارة الإنترنت 50 نانوغرام/مل جاسترين 10 مليون متر A83-01 500 مليون متر الجدول 1: تكوين وسائط الإعلام من أجل النمو والتمايز في وسائط الإعلام.

Discussion

مسببات الأمراض المعوية في معظم الأحيان بدء دورة حياتها عن طريق إصابة الخلايا الظهارية المعوية من جانبها apical التي تواجه تجويف الأمعاء. في حين أن الأجهزة العضوية معترف بها جيدا لتكون نموذجا جيدا لإعادة إنتاج التعقيد الخلوي وتنظيم الظهارة المعوية ، فإن تنظيمها كهياكل ثلاثية الأبعاد ومغلقة تجعل غشاءها apical غير قابل للوصول إلى الممرض. وصف هذا البروتوكول طرق إصابة الأجهزة العضوية المعوية من جانبها القردي ، أو جانبها القاعدي ، أو كليهما بمسببات الأمراض BLS-3. يمكن بسهولة تكييف هذه البروتوكولات لدراسة أي مسببات أمراض دخولية تحت احتواء BSL-2 أو BLS-3 أو أي نموذج عضوي آخر باتباع بعض الخطوات الحرجة التي يتم تسليط الضوء عليها أدناه. الطريقة المذكورة أعلاه هي لعزل وإعداد قطرات أحادية الخلية وفقا للوائح في ألمانيا. 10- وإخلاء المسؤولية، لا يصف هذا البروتوكول تدابير معالجة السلامة الأحيائية (إجراءات التشغيل الموحدة) التي يلزم اتخاذها أثناء العمل في إطار شروط BSL-3. ومن المهم أيضا الإصرار على أن اللوائح قد تختلف في بلدان أخرى وأنه يجب الاتصال بالسلطات المحلية للتأكد من احترام جميع اللوائح المحلية.

واحدة من الخطوات الحاسمة في بذر organoids في بعدين للعدوى apical هو السيطرة على أن الخلايا سوف تفرق بالمثل بالمقارنة مع عندما تزرع كما organoids ثلاثية الأبعاد الكلاسيكية. اعتمادا على الممرض المعوي ، يمكن أن يقتصر التروبزم على خلايا نادرة جدا أو على الخلايا التي تحتاج إلى تمييز كبير. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي استخدام عضو ثنائي الأبعاد لم يفرق تماما إلى سوء الدمج بأن هذا الممرض المعوي لا يمكن أن يصيب الأعضاء المعوية. ويقترح، إن أمكن، إجراء العدوى باستخدام التكوينات الثلاثة لهذا البروتوكول: 2D organoid للعدوى apical فقط (القسم 2)، متصدع الأجهزة العضوية 3D مفتوحة للعدوى apical وbasolateral (القسم 3)، والأعضاء 3D الكامل للعدوى القاعدية فقط (القسم 3). وسيساعد هذا النهج على تمييز مسار دخول العامل الممرض (apical vs. basolateral) وسيتحكم أيضا في تحقيق مستوى مماثل من التمايز. البديل للعدوى 2D apical هو microinjection ، والتي سوف تستخدم 3D organoid ولكن تسليم الممرض مباشرة إلى الجانب apical (انظر بارتفيلد وآخرون27 للحصول على تفاصيل). تتطلب هذه الطريقة حاقن ماهر لضمان وضع الممرض بشكل صحيح ، وتظل الأعضاء العضوية سليمة. يستخدم الميكروينيكشن عادة في احتواء BSL-2 وقد لا يكون مناسبا لاحتواء BSL-3.

وهناك اعتبار مهم إضافي عند إجراء تجارب العدوى في الأجهزة العضوية ذات البذور 2D هو كثافة الخلية النهائية. كما ذكر في الخطوة 2.3، سيتم بذر 100-150 organoids في بئر واحد من لوحة 48 جيدا أو بئر واحد من شريحة غرفة زجاجية القاع 8 جيدا. اعتمادا على خط organoid وعلى الشخص الذي يتعامل مع organoids ، يمكن أن يكون حجم هذه organoids مختلفة بشكل كبير. وهذا يمكن أن يؤدي إلى كثافات خلايا مختلفة جدا في لوحة 48 جيدا أو 8-جيدا الزجاج القاع الشريحة الغرفة. اعتمادا على الفيروس المعوي، تفضل بعض الفيروسات خلايا أكثر متناثرة، في حين أن البعض الآخر سوف تكون أيضا قادرة على إصابة الخلايا التقاء. الأصل الجزيئي لمثل هذه الاختلافات في العدوى لالتقاء الخلايا المختلفة غير واضح. ولذلك، ينبغي إجراء تجارب تجريبية تهدف إلى إيجاد أفضل كثافة خلايا لمسبب الأمراض المعوي الذي يختاره قبل إجراء المزيد من التوصيف في المصب.

غالبا ما يتم إجراء فرز FACS قبل إجراء مستحلب قطرة الخلية الواحدة. وغالبا ما تستخدم هذه الخطوة لفصل الميت من الخلايا الحية والخلايا المفردة من doublets. عند العمل مع مسببات الأمراض BSL-3 ، فإنه يتطلب أن يكون المرفق مجهزا بفرز FACS مناسب ، وهو ما لا يحدث في كثير من الأحيان. علاوة على ذلك ، ليس كل الخلايا في الجهاز بنفس الحجم ، وغالبا ما يكون من الصعب التمييز بين مزدوج أو خلية أكبر ، مما يسبب خطر الاختيار السلبي ضد نوع خلية محددة. كما لا تزال هناك مناقشة في الميدان حول ما إذا كان الوقت اللازم لفرز ما بين 5000-10000 لكل عينة يمكن أن يؤدي إلى تعديل كبير في ملف تعريف النص للخلايا الفردية. في حين تم وصف طرق تثبيت الخلية المتوافقة مع تسلسل الخلية الواحدة (على سبيل المثال ، الميثانول وRNAassist) ، لوحظ أن هذا يؤدي إلى انخفاض في جودة التسلسل18. وأخيرا، يشتبه في أن فرز الخلايا باستخدام علامات موت الخلية يمكن أن يؤدي أيضا إلى التحيز. وبالنظر إلى الانتشار الاتجاهي والتمايز للخلايا من خلال محور سرداب زغب، وتقع الخلايا الأكثر تميزا، والتي سوف يتم تسليطها والإفراج عنها، في غيض من الزغب. غالبا ما تكون هذه الخلايا إيجابية بالنسبة للعلامات المختلفة لمسارات موت الخلايا(مثل موت الخلايا المبرمج والنخر والنخر)؛ ومع ذلك ، عند النظر إلى عدوى فيروس الروتا في أمعاء الماوس ، فإن طرف الزغب هو المنطقة الأكثرإصابة 28. وبالتالي، فإن تصفية الخلايا التي قد تبدو إيجابية لعلامات الموت سيؤدي إلى اختيار سلبي للخلايا المصابة التي قد تمثل العدوى الفسيولوجية. حاليا، لا يوجد حل جيد لفرز وإصلاح organoids قبل تسلسل خلية واحدة. يوصى باستخدام الخلايا الحية غير المفتورة حيث يلزم إجراء مزيد من الدراسات للعثور على بروتوكولات بديلة مناسبة.

أحدث تسلسل الخلية الواحدة ثورة في كيفية تقييم الاستجابات الخلوية. تسمح هذه التقنية بتحديد الاستجابات الخاصة بخلايا النسب سواء في الحالات القاعدية أو في حالات العدوى المسببة للأمراض. فتحت هذه الطريقة الأبواب في العديد من الحقول التي كانت محدودة سابقا بواسطة قراءات مجمعة. في حين أن هذا الأسلوب هو قوي جدا، لديها حدودها. ويتمثل أحد القيود الرئيسية في التحليل المعلوماتي الحيوي الشامل المطلوب في المصب للتسلسل. هذا هو المفتاح خاصة عند تحليل الأنسجة وتعيين أنواع الخلايا حيث لا يوجد حاليا أي تعليق توضيحي. وجود المعلوماتية الحيوية المهرة مطلوب لدعم جميع الدراسات وحيدة الخلية.

يصف هذا البروتوكول كيفية زرع ومعالجة الأجهزة العضوية المعوية البشرية ، وتصيبها بمسببات الأمراض المعوية ، وأداء scRNAseq. أصبح تكييف هذا النهج مع الأعضاء الأخرى ممكنا الآن ، حيث تم تطوير أنظمة نموذجية عضوية لمعظم الأعضاء. وبالمثل يتم تنظيم أعضاء الرئة والكبد مقارنة بالأعضاء المعوية ، وعلى هذا النحو ، يمكن نقل استخدام نهج مماثل إلى هذه الأعضاء العضوية. وسوف تكون السيطرة الحاسمة للتحقق من أنه عندما نمت في بعدين أو متصدع مفتوحة، وهذه organoids تحقيق تمايز مماثل لنظرائهم organoid 3D. السمات والجينات المحددة التي تحدد حالة متمايزة محددة لكل نموذج عضو. نماذج عضوية أخرى مثل أعضاء الكلى والأوعية الدموية ، والهياكل الكثيفة الكبيرة ، ستحتاج إلى طرق إضافية لتفكيك هذه الهياكل بشكل متسلسل إلى خلايا واحدة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ميغان ستانيفر وستيف بولانت تم دعمهما بمنح بحثية من دويتشه فورشونجسجيمينشافت (DFG): (رقم المشروع 240245660، 278001972 415089553 272983813 إلى ستيف بولانت 416072091 إلى ميغان ستانيفر) وولاية بادن فورتمبرغ والبوندسمينستيريوم فور بيلونغ أوند فورشونغ BMBF 01KI20239B إلى MS و01KI20198A و (NUM-COVID 19، تم إنشاء الأورجانو سترات 01KX2021) إلى المخططات SB. في BioRender.

Materials

 Recombinant mouse noggin Peprotech Cat#250-38
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich Cat# G9145
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fischer Scientific Cat#25300054
24-well non-cell culture treated plate Corning Cat#3738
8-well glass bottom chamber slide iBIDI Cart#80827
A83-01 Tocris Cat#2939
Advanced DMEM/F12 Thermo Fischer Scientific Cat# 12634010
B27 Thermo Fischer Scientific Cat#17504-044
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics Cat#1000202 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit 10X Genomics Cat #1000127 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 10X Genomics Cat#1000268 Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM)
Collagen from human placenta Sigma Aldrich Cat#C5533-5MG
CYP34A forward Eurofins GATGGCTCTCATCCCAGACTT Primers used to check for differentiation
CYP3A4 reverse Eurofins AGTCCATGTGAATGGGTTCC Primers used to check for differentiation
DMEM/F12 Thermo Fischer Scientific Cat#11320074
EDTA Sigma Aldrich Car#E9884
Fast Read 102 counting slides Biosigma Cat# BVS100
Fetal Bovein Serum (FBS) Capricorn Cat#FBS-12A
GlutaMAX Thermo Fischer Scientific Cat# 35050061
HEPES Thermo Fischer Scientific Cat3 15630080
L-WRN cells ATCC CRL-3276 This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site.
MatriGel. GFR, LDEV free Corning Cat#354230
MUC-2 forward Eurofins TGTAGGCATCGCTCTTCTCA Primers used to check for differentiation
MUC-2 reverse Eurofins GACACCATCTACCTCACCCG Primers used to check for differentiation
N-acetyl-cysteine Sigma Aldrich Cat# A9165
OLMF4 forward Eurofins ACCTTTCCCGTGGACAGAGT Primers used to check for differentiation
OLMF4 reverse Eurofins TGGACATATTCCCTCACTTTGGA Primers used to check for differentiation
Penicillin/Streptomycin Thermo Fischer Scientific Cat#15140122
Recombinant human FGF basic Peprotech Cat#100-18B
Recombinant human IGF-1 BioLegend Cat#590904
Recombinant mouse EGF Thermo Fischer Scientific Cat# PMG8043
SI forward Eurofins AATCCTTTTGGCATCCAGATT Primers used to check for differentiation
SI reverse Eurofins GCAGCCAAGAATCCCAAT Primers used to check for differentiation
TrypLE Express Thermo Fischer Scientific Cat#12605036
Y-27632 Caymann Chemicals Cat#10005583

References

  1. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).
  2. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  4. Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection. Cells. 9, (2020).
  5. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).
  6. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).
  7. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  9. de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. Human norovirus transmission and evolution in a changing world. Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).
  10. Leshem, E., et al. Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel. Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, 155-160 (2016).
  11. Karst, S. M. The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).
  12. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353, 1387-1393 (2016).
  13. de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).
  14. Scaldaferri, F., et al. The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications. Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).
  15. Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test. Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).
  16. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369, 50-54 (2020).
  17. Stanifer, M. L., et al. Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells. Cell Reports. 32, 107863 (2020).
  18. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. bioRxiv. , (2020).
  19. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Molecular Systems Biology. 17, 10232 (2021).
  20. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
  21. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).
  22. García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection. Viruses. 12, 1288 (2020).
  23. Stanifer, M. L., et al. Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells. Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).
  24. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478 (2019).
  25. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483 (2015).
  26. Fujii, M., et al. Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
  27. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359 (2015).
  28. Hernandez, P. P., et al. Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection. Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).

Play Video

Cite This Article
Stanifer, M. L., Boulant, S. Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions. J. Vis. Exp. (175), e62857, doi:10.3791/62857 (2021).

View Video