Describimos una técnica de disección que preserva la arquitectura de la unión neuromuscular y permite un estudio inmunocitoquímico detallado de las neuronas motoras en la pierna adulta de Drosophila .
Drosophila melanogaster representa un modelo genéticamente tratable para estudiar la estructura y función neuronal, y los cambios posteriores en los estados de enfermedad. La unión neuromuscular larvaria bien caracterizada se utiliza a menudo para tales estudios. Sin embargo, el rápido desarrollo larvario seguido de histólisis muscular y remodelación del sistema nervioso durante la metamorfosis hace que este modelo sea problemático para el estudio de cambios degenerativos lentos dependientes de la edad como los que ocurren en la esclerosis lateral amiotrófica. Alternativamente, las moscas adultas viven durante 90 días y la pata adulta se puede usar para estudiar los cambios en las neuronas motoras en el transcurso de la vida adulta utilizando imágenes fluorescentes in vivo a través de la cutícula. Aquí, describimos una técnica de disección de piernas junto con inmunocitoquímica, que permite el estudio de cambios moleculares en la unión neuromuscular de las neuronas motoras de piernas adultas identificadas. Estas técnicas se pueden combinar con una miríada de anticuerpos que marcan estructuras pre y postsinápticas. Juntos, estos procedimientos permiten una caracterización más completa de los cambios lentos dependientes de la edad en moscas adultas y se pueden aplicar a través de múltiples modelos de enfermedades de neuronas motoras.
Las enfermedades de la neurona motora (MN) abarcan un grupo de afecciones heterogéneas que incluyen la degeneración progresiva que conduce al desgaste muscular y la parálisis como fenotipo clínico primario1. Aunque es raro con una prevalencia global de 4,5 por 100.000, se espera que esta prevalencia aumente con el envejecimiento de la población2. La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es la enfermedad MN (EMN) más común y suele ser mortal en un corto período de tiempo desde el diagnóstico sin tratamientos modificadores de la enfermedad disponibles3. Las ETN comparten en común una fase presintomática prolongada con cambios tempranos en los biomarcadores moleculares y cambios en la imagen funcional observados en los pacientes4. La patología celular presintomática temprana también se observa en modelos de enfermedades no humanas5,6,7,8. El estudio de los cambios tempranos en la unión neuromuscular es importante para comprender la patogénesis de la enfermedad de MN y puede ayudar a desarrollar diagnósticos tempranos y posibles terapias.
Existe una gran cantidad de herramientas genéticas y moleculares en Drosophila para diseccionar la estructura y función de la unión neuromuscular (NMJ, ver9 para una revisión de la NMJ larvaria bien caracterizada). Estas herramientas combinadas con una corta vida útil hacen de Drosophila un excelente modelo para estudiar los cambios neurodegenerativos en el NMJ. Específicamente, las NM que inervan los músculos adultos están presentes a lo largo de la vida adulta de ~ 90 días y están sujetas a procesos normales de envejecimiento10,11,12,13. Por lo tanto, las NM adultas brindan la oportunidad de estudiar cambios degenerativos lentos en contraste con las NMJ larvales que existen solo durante un corto período de tiempo de ~ 1 semana antes de la metamorfosis14,15.
Aquí, describimos un procedimiento de disección que nos permite realizar análisis inmunocitoquímicos de las EM en la pierna adulta. Cada pierna adulta está inervada por ~ 50 MNs, que hacen sinapsis en la pierna muscular asociada para impulsar la locomoción. La anatomía de las piernas, la fisiología mecánica y la neurobiología han sido bien descritas16,17,18. Los cenadores axónicos de las MN de las patas se han caracterizado previamente por imágenes a través de la cutícula en poblaciones celulares rellenas o genéticamente marcadas utilizando el sistema bipartito Gal4/UAS y los métodos de imagen se han publicado anteriormente19. Los métodos de disección presentados aquí preservan la morfología de ramificación del axón y nos permiten explotar una amplia gama de anticuerpos para etiquetar diferentes componentes moleculares del NMJ. Nuestro trabajo anterior se ha centrado en las proyecciones de un MN definido en la pierna metatorácica (3ª), que inerva el músculo elevador de la tibia (tilm) y muestra patrones de arborización consistentes y números de bouton. Inicialmente estudiamos los cambios dependientes de la edad en los mutantes de la superóxido dismutasa 1 (dsod1) de Drosophila y encontramos alteraciones consistentes con el desmantelamiento de la NMJ20. Estos métodos de disección ofrecen la oportunidad de caracterizar mejor los cambios degenerativos lentos en el NMJ para otros modelos de ELA, estudios básicos del envejecimiento y otras enfermedades asociadas a la EMN.
Figura 1. Resumen del flujo de trabajo para diseccionar piernas. Consulte el protocolo para conocer los pasos detallados. (A,B) Las moscas son seleccionadas y anestesiadas. (C) Las moscas se transfieren a metanol y se lavan con PBS. (D) Las patas metatorácicas se eliminan en la base de la coxa mientras se visualizan con un microscopio de disección (~ 30x de aumento); barra de escala = 500 μm. (E) Las patas se fijan en una solución de formaldehído/PBS (FA) al 3,7% durante 30 minutos dentro de pocillos de placas de 24 pocillos y luego se elimina la FA mediante lavados con PBS. (F, G, H) Las piernas se transfieren a bandejas de disección de elastómero de silicona y se extrae un trozo de cutícula del fémur proximal utilizando fórceps biselados mientras se visualiza bajo un microscopio de disección a 80x; barra de escala = 50 μm. (I) Las patas se fijan después de la disección en FA y se lavan en PBS y luego en PBT (PBS + 0.1% surfactante no iónico). (J) Las piernas son sometidas a tinción inmunocitoquímica. (K,L) Las patas se transfieren a un portaobjetos de vidrio, se limpian en medios de montaje y se cubren con una funda que contiene espaciadores de arcilla; barras de escala = 2 mm y 500 μm. (M) Las piernas se visualizan mediante microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La pierna adulta de Drosophila es un modelo ideal para estudiar la neurodegeneración dada la relativa simplicidad con MN bien caracterizadas mapeadas a partir de linajes de neuroblastos y patrones de arborización estereotipados. Varios informes han utilizado previamente las MN de piernas para el estudio de la enfermedad neurodegenerativa21,22. Estos estudios utilizaron líneas que expresan GFP combinadas con análisis de mosaico con un marcador celular represible (MARCM) para obtener imágenes a través de la cutícula y documentaron una serie de cambios morfológicos. La obtención de imágenes de NMJ adultos por inmunocitoquímica con cutícula resecada permite una caracterización adicional con la capacidad de rastrear cambios moleculares complejos utilizando una caja de herramientas de anticuerpos disponibles.
La parte de inmunocitoquímica de este protocolo es relativamente estándar y se puede implementar independientemente del genotipo (ver23 para una excelente descripción de los métodos generales de tinción de anticuerpos para su uso con Drosophila). Además, parámetros como la intensidad de la fluorescencia, la longitud de la rama del axón y el número y tamaño del bouton se pueden determinar utilizando una variedad de macros ImageJ disponibles una vez que se capturan las imágenes y se han publicado métodos detallados para el análisis cuantitativo (por ejemplo, ver24,25,26). Por lo tanto, la técnica de disección es la principal innovación descrita aquí. Antes de la disección, las moscas se sumergen en un alcohol para eliminar los hidrocarburos cuticulares. Tanto el etanol como el metanol se usan comúnmente para este propósito; sin embargo, solo hemos utilizado metanol. Críticos para el éxito de la disección son varios factores: Primero, el uso de fórceps modificados con un bisel permite un contacto muy superficial con la cutícula. En segundo lugar, utilizando un microscopio de disección capaz de un aumento total de 60-100x para que la superficie de la cutícula sea claramente visible. Para microscopios con un aumento máximo más bajo, los objetivos 2x están disponibles para las marcas más comunes y deberían ser suficientes cuando se combinan con lentes existentes. En tercer lugar, el paso de fijación inicial hace que la cutícula sea frágil y más fácil de alejar sin dañar el músculo debajo. La fijación excesiva en este paso hace que toda la pierna esté demasiado rígida para una disección efectiva. Por lo tanto, la fijación inicial debe limitarse a 30 minutos. El fijador de formaldehído no penetrará lo suficiente como para reticular eficazmente el tejido subyacente durante este corto período y, por lo tanto, es necesario un segundo paso de fijación. Antes de la segunda fijación, los tejidos deben mantenerse en hielo para evitar la degradación y los cambios en la morfología. Cuarto, hemos encontrado que diseccionar muestras mientras que el frío también es importante, probablemente por razones similares en que la cutícula es frágil y una pieza pequeña se puede quitar más fácilmente.
Con la práctica, encontramos que ~ 50% de las disecciones serán utilizables sin daño tisular discernible. Aunque este porcentaje puede parecer bajo en relación con algunos otros tejidos, el procedimiento de disección es rápido y muchas piernas se pueden procesar en 30-60 minutos. Por lo tanto, incluso si las tasas de éxito son bajas inicialmente, es factible obtener 4-5 buenas muestras para cada grupo experimental. Sin embargo, una limitación puede ser el número de moscas disponibles en un momento dado si los genotipos y / o la edad resultan en una letalidad sustancial.
Otra limitación es que no hemos podido diseccionar otras zonas de la pierna más allá de la región proximal del fémur debido al tamaño. Por lo tanto, podemos estudiar los cenadores MN identificados que inervan el TILM de manera confiable y es posible diseccionar la cutícula por encima del músculo depresor de la tibia con pequeños cambios en la forma en que se orienta la pierna al diseccionar. Sin embargo, el acceso a otras regiones de la pierna ha resultado más difícil sin interrumpir la arquitectura axonal durante la disección.
Aquí, presentamos métodos de disección para detectar cambios en la NMJ adulta para MNs definidas que inervan el tilm utilizando inmunocitoquímica. La pierna es útil como un sistema simple, inervada por solo ~ 50 MN y que contiene 14 músculos con una anatomía bien descrita. La preparación de la pierna diseccionada se puede utilizar en todos los genotipos y un conjunto de anticuerpos están disponibles para la visualización de NMJ sin la necesidad de construir existencias genotípicamente complejas de construcciones de genes reporteros en fondos mutantes. Este enfoque permitirá una caracterización más detallada de los cambios en el NMJ para las enfermedades de MN y otras afecciones relacionadas con la edad.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Eric Roberts por sus consejos sobre imágenes. También deseamos agradecer a los Servicios de Tecnología de la Información en Rhode Island College y, en particular, a Michael Caine y Jake Douglas por la videografía. Los anticuerpos monoclonales anti-dlg y anti-brp fueron desarrollados por UC-Berkeley y Universitaetsklinikim Wuerzburg respectivamente, y se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank, creado por el NICHD de los NIH y mantenido en la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA 52242, EE. UU. La investigación reportada aquí fue apoyada completamente por la Red de Excelencia en Investigación Biomédica del Premio de Desarrollo Institucional de Rhode Island (IDeA) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de subvención [P20GM103430].
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |