Summary

Система культуры органов кишечника для анализа взаимодействия хозяина и микробиоты

Published: June 30, 2021
doi:

Summary

В этой статье представлен уникальный метод анализа взаимодействий хозяина и микробиома с использованием новой системы культуры органов кишечника для экспериментов ex vivo.

Abstract

Структура ткани кишечника способствует тесному и взаимному взаимодействию между хозяином и кишечной микробиотой. Эти перекрестные переговоры имеют решающее значение для поддержания местного и системного гомеостаза; изменения в составе микробиоты кишечника (дисбактериоз) связаны с широким спектром заболеваний человека. Методы препарирования взаимодействий хозяина и микробиоты включают в себя неотъемлемый компромисс между сохранением физиологической структуры ткани (при использовании животных моделей in vivo) и уровнем контроля над факторами эксперимента (как в простых системах культивирования клеток in vitro). Чтобы устранить этот компромисс, Yissachar et al. недавно разработали систему культуры кишечных органов. Система сохраняет наивную конструкцию ткани толстой кишки и клеточные механизмы, а также позволяет осуществлять жесткий экспериментальный контроль, облегчая эксперименты, которые не могут быть легко выполнены in vivo. Он оптимален для рассечения кратковременные реакции различных компонентов кишечника (таких как эпителиальные, иммунологические и нейронные элементы) на просветные возмущения (включая анаэробные или аэробные микробы, образцы целой микробиоты от мышей или людей, лекарства и метаболиты). Здесь мы представляем подробное описание оптимизированного протокола для культуры органов из нескольких фрагментов кишечника с использованием специально изготовленного устройства для культивации кишечника. Реакции хозяина на люминальные возмущения могут быть визуализированы иммунофлуоресцентным окрашиванием участков ткани или фрагментов ткани целиком, флуоресцентной гибридизацией in-situ (FISH) или покадровой визуализацией. Эта система поддерживает широкий спектр считывания, включая секвенирование следующего поколения, проточную цитометрию и различные клеточные и биохимические анализы. В целом, эта трехмерная система культуры органов поддерживает культуру больших, интактных тканей кишечника и имеет широкое применение для анализа высокого разрешения и визуализации взаимодействий хозяина и микробиоты в местной кишечной среде.

Introduction

Кишечник является очень сложным органом, содержащим широкий спектр типов клеток (эпителиальные клетки, клетки иммунной системы, нейроны и т. Д.), Организованный в определенную структуру, которая позволяет клеткам взаимодействовать и общаться друг с другом и с содержанием просвета (микробиота, пища и т. Д.). 1. В настоящее время исследовательский инструментарий, доступный для анализа взаимодействий хозяина и микробиоты, включает в себя культуры клеток in vitro и модели животных in vivo 2. Животные модели in vivo обеспечивают физиологическую тканевую конструкцию3, но с плохим экспериментальным контролем и ограниченной способностью манипулировать условиями эксперимента. Системы культивирования in vitro, с другой стороны, используют первичные клетки или клеточные линии, которые могут быть дополнены микробами4,предлагая жесткий контроль над параметрами эксперимента, но не имея клеточной сложности и архитектуры тканей. Современные анализы in vitro позволяют использовать расширенные образцы здоровых и патологических тканей человека, такие как эпителиальные органоиды, полученные из мышиных или человеческих источников5,6,и образцы, которые имитируют микросреду слизистой оболочки7. Другим примером является анализ «кишечник на чипе», который включает в себя эпителиальную клеточную линию толстой кишки человека (Caco2), внеклеточный матрикс и микрофлюидные каналы для имитации физиологического состояния инварианта кишечника8. Однако, какими бы продвинутыми и инновационными ни были образцы in vitro, они не поддерживают нормальную тканевую архитектуру или наивный клеточный состав.

Чтобы решить эту проблему, Yissachar et al. недавно разработали систему культуры органов ex vivo 9 (рисунок 1),которая поддерживает неповрежденные фрагменты кишечника ex vivo,извлекая выгоду из преимуществ моделей как in vivo, так и in vitro. Эта система культивирования органов кишечника ex vivo основана на специально изготовленном устройстве для культивирования, которое поддерживает мультиплексированную культуру шести тканей толстой кишки, позволяя исследовать экспериментальные входы в сопоставимых условиях, контролируя входы и выходы системы. Недавние работы продемонстрировали, что эта система ценна для анализа кишечных реакций на отдельные кишечные бактерии9,образцы всей микробиоты человека10 и микробные метаболиты11. Эта система позволяет впервые изучать эти ранние взаимодействия хозяин-микробиота с высоким уровнем контроля над компонентами хозяина, микробами и окружающей средой. Кроме того, он позволяет контролировать и манипулировать системой на протяжении всего эксперимента в режиме реального времени.

Figure 1
Рисунок 1:Схемы устройства кишечной культуры. Целый фрагмент кишечной ткани прикрепляется к выходному и входному портам камеры (верхней), с насосами, регулирующими поток среды внутри просвета и во внешней средней камере. Все устройство (днище) содержит 6 таких камер. Эта цифра была изменена с Yissachar et al. 2017. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Этот протокол следует руководящим принципам ухода за животными, утвержденным комитетом по этике для защиты животных. 1. Подготовка эксперимента Изготовление устройства для культивирования органов кишечника (3 дня) С помощью 3D-принтера распечатайте многоразовы…

Representative Results

Система культивирование органов кишечника поддерживает жизнеспособность тканей ex vivo. Оценка жизнеспособности тканей проводилась на протяжении всего периода культивации. Фрагменты ткани толстой кишки инкубировали в системе культуры органов кишечника и фиксировали после культу…

Discussion

В этой статье описывается оптимизированный протокол для культур органов кишечника ex vivo, который недавно разработали Yissachar et al. (опубликованные9 и неопубликованные данные). Система культуры органов кишечника поддерживает мультиплексированную культуру неповрежденных …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим бывших и нынешних членов лаборатории Иссахара за их ценный вклад в оптимизацию протокола системы культуры органов кишечника. Мы благодарим Яэль Лор за критическое редактирование рукописи. Эта работа была поддержана Израильским научным фондом (грант No 3114831), Совместным фондом израильского научного фонда – Института Броуда (грант No 8165162) и Фондом медицинских исследований Гасснера, Израиль.

Materials

Device
18 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a754
22 Gauge Blunt Needle Mcmaster 75165a758
All Purpose Adhesive Selant 100% Silicone DAP 688
Cubic Vacuum Desiccator VDC-21+ 2 Shelves AAAD4021
Glass Slide 1 mm Thick Corning 2947-75X50
Mini Incubator im-10 AAH24315K
MPC 301E Vacuum PUMP VI-412711
Plastic Quick Turn Tube Coupling Plugs Mcmaster 51525k121
plastic Quick Turn Tube Coupling Sockets Mcmaster 52525k211
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Polydimethylsiloxane, PDMS
Tubing Mcmaster 6516t11
Zortrax M200 Zortrax Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 Materials: z-ultrat Zortrax
Medium
B27 Supplement (50x), Serum Free Thermo Fisher Scientific 17504044
HEPES Buffer (1M) Thermo Fisher Scientific 15630056
Iscove's Mod Dulbecco's Medium With Phenol Red (1x) Thermo Fisher Scientific 12440061
Knock-Out Serum Thermo Fisher Scientific 10828028
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific A1370701
Non Essential Amino Acid (100x) Thermo Fisher Scientific 11140035
Surgical Tools
Large Scissors Aseltech 11-00-10
Sharp Forceps F.S.T 11297-10
Silk Braided Surgical Thread SMI 8010G
Straight Scissors F.S.T 14091-09
Thin Forceps F.S.T 11051-10
Organ System
0.1 µm Filter Life Gene
0.22 µm Filter Life Gene
5 mL Luer Lock Syringe B-D 309649
Greenough Stereo Microscope ZEISS Stemi 305
Recirculating Precision Air Heater "CUBE" CUBE-2-LIS
Syringe Pump new era pump systems inc nep-ne-1600-em

References

  1. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  2. Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
  3. Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
  4. Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  5. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  6. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  7. Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
  8. Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014 (2021).
  9. Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
  10. Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
  11. Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
  12. Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  13. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  14. Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
  15. Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
  16. Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).

Play Video

Cite This Article
Azriel, S., Bootz, H., Shemesh, A., Amidror, S., Yissachar, N. An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions. J. Vis. Exp. (172), e62779, doi:10.3791/62779 (2021).

View Video