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Immunology and Infection

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

A detecção de interações hospedeiras-bacterianas baseadas na adesão fenotípica usando imagens de rotulagem de fluorescência de alto rendimento, juntamente com métodos automatizados de análise estatística, permite uma avaliação rápida de possíveis interações bacterianas com células hospedeiras.

Abstract

A identificação de patógenos bacterianos emergentes é fundamental para a saúde e segurança humana. A adesão bacteriana às células hospedeiras é um passo essencial em infecções bacterianas e constitui uma marca de ameaça potencial. Portanto, examinar a adesão de bactérias às células hospedeiras pode ser usado como um componente da avaliação de ameaças bacterianas. Um método padrão para enumerar a adesão bacteriana às células hospedeiras é co-incubar bactérias com células hospedeiras, colher as bactérias aderentes, emplacar as células colhidas em meios sólidos e, em seguida, contar as unidades de formação de colônias resultantes (UFC). Alternativamente, a adesão bacteriana às células hospedeiras pode ser avaliada usando abordagens baseadas em microscopia de imunofluorescência. No entanto, as estratégias convencionais para a implementação dessas abordagens são demoradas e ineficientes. Aqui, um método de imagem baseado em microscopia de fluorescência automatizada recentemente desenvolvido é descrito. Quando combinado com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística, o método permite quantificação rápida de bactérias que aderem às células hospedeiras. Duas espécies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa gram-negativa e monocytogenes listeria gram-positiva e controles negativos correspondentes, foram testadas para demonstrar o protocolo. Os resultados mostram que essa abordagem enumera de forma rápida e precisa as bactérias aderentes e reduz significativamente as cargas de trabalho experimentais e cronogramas.

Introduction

A adesão bacteriana é um processo pelo qual as bactérias se ligam a outras células ou superfícies. O estabelecimento bem-sucedido de infecção por patógenos bacterianos requer adesão às células hospedeiras, colonização de tecidos e, em alguns casos, invasão de células hospedeiras1,2,3. As doenças infecciosas emergentes constituem grandes ameaças à saúde pública, como evidenciado pela recente pandemia COVID-194,5,6. É importante ressaltar que patógenos novos ou emergentes podem não ser facilmente discernidos usando abordagens genômicas, especialmente nos casos em que o patógeno foi projetado para escapar da detecção ou não contém assinaturas genômicas que o identificam como patogênico. Portanto, a identificação de potenciais patógenos utilizando métodos que avaliam diretamente marcas de patogenicidade, como a adesão bacteriana às células hospedeiras, pode desempenhar um papel crítico na identificação de patógenos.

A adesão bacteriana às células hospedeiras tem sido usada para avaliar mecanismos de patogênese bacteriana há décadas1,7. A imagem microscópica8,9 e a enumeração da unidade formadora de colônias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por revestimento pós-infecção são dois métodos laboratoriais bem desenvolvidos para testar a adesão microbiana e/ou infecção das células hospedeiras14. Considerando o tamanho da escala de micrômetros das células bacterianas, a enumeração das células bacterianas aderentes geralmente requer o uso de técnicas avançadas de microscopia de alta ampliação, bem como abordagens de imagem de alta resolução, incluindo microscopia eletrônica, microscopia de expansão (ExM)15,16e imagem tridimensional17 . Alternativamente, a enumeração de bactérias vinculadas ou internalizadas dentro das células hospedeiras pode ser realizada emplacando a série de diluição de bactérias colhidas em ágar sólido e contando as CFUs resultantes10,12,13. Este método é trabalhoso e inclui muitas etapas manuais, o que introduz dificuldades no estabelecimento de um procedimento padronizado ou automatizado necessário para análises de alto rendimento18,19. Portanto, o desenvolvimento de novos métodos para avaliar o anexo de células hospedeiras abordaria as limitações atuais no campo.

Um desses métodos é descrito aqui que utiliza microscopia automatizada de alto rendimento, combinada com processamento de imagem de alto rendimento e análise estatística. Para demonstrar a abordagem, foram realizados experimentos com diversos patógenos bacterianos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, um patógeno bacteriano gram-negativo oportunista de humanos, animais e plantas14,20, que é frequentemente encontrado para colonizar o trato respiratório de pacientes com funções de defesa hospedeiras prejudicadas. Essa abordagem otimou o processo de imagem microscópica descrito em estudos anteriores14,20. A detecção de imagens foi simplificada por células hospedeiras e bactérias rotuladas por fluorescência para rastrear rapidamente a proximidade delas, o que reduziu drasticamente a carga de trabalho de microscopia para obter imagens de alta resolução para distinguir bactérias. Além disso, a análise estatística automatizada de imagens na contagem de células hospedeiras e bactérias substituiu o experimento manual de revestimento de CFU bacteriano para estimar a razão da contagem bacteriana aderente por célula hospedeira. Para confirmar a compatibilidade deste método, também foram testadas múltiplas cepas bacterianas e tipos de células hospedeiras, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Klebsiella pneumoniae, bem como células endotelias de veia umbilicais humanas (HUVECs), e os resultados apoiam a diversidade e eficácia do método.

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Protocol

1. Cultura celular A549

  1. Mantenha a linha celular A549 em meio F-12K suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e incubar a 37 °C, 5% DE CO2.
  2. Mude o meio a cada 3-4 dias e passagem em 85%-95% de confluência.
  3. Brevemente, enxágue as células com 1 x soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS, pH 7.4, a menos que indicado de outra forma) e trate com 1 ml de 0,25% trypsin-0,53 mM solução de ácido ethylenodiaminatotracético (EDTA) (submergir a camada celular) por cerca de 2 min a 37 °C.
  4. Adicione 6 mL adicionais de meio de crescimento completo (meio F-12K + 10% FBS) para interromper a atividade de protease. Em seguida, plaque as células em um frasco de cultura tecidual estéril T-75 a uma proporção de subcultivação de 1:3-1:8. O volume final da cultura é de 12 mL.
  5. Semente aproximadamente 1 x 104 células A549 (concentração celular: ~1 x 105 células/mL) em cada poço de uma placa de 96 poços um dia antes dos ensaios de adesão.

2. Crescimento bacteriano e coloração

  1. Realize todos os trabalhos bacterianos em um gabinete de biossegurança, laboratório de Biossegurança Nível 2.
  2. Inocular todas as culturas bacterianas, incluindo P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes, e B. subtilis, etc., do estoque de glicerol congelado e cultivá-los em Broto de Soja Tripptic (TSB, 3 mL) em uma incubadora de tremor a 37 °C durante a noite mantida a 250 rpm.
  3. No dia seguinte, use uma diluição de 1:100 da cultura da noite para inocular uma subcultura e cultuá-las em TSB (1 mL) por 3h à fase exponencial, medir o OD em 600 nm (OD600) para confirmar. Certifique-se de que o OD600 está na faixa de 0,4-0.6.
  4. Antes de realizar o ensaio de adesão do hospedeiro de bactérias, as diluições em série de placas de suspensão bacteriana em placas de ágar TSB, incubam-nas durante a noite a 37 °C e, em seguida, estabelecem as CFUs bacterianas do número de colônias. Para P. aeruginosa, um OD600 de 1,0 corresponde a 2 x 108 células bacterianas viáveis/mL, e para L. monocytogenes,um OD600 de 1,0 corresponde a 9 x 108 células bacterianas viáveis/mL.
  5. Colher as culturas bacterianas em fase exponencial por centrifugação a 13.000 x g por 2 min a temperatura ambiente (RT), depois lave-as uma vez usando 1x PBS (1 mL). Resuspenda as pelotas bacterianas em 1 mL de 1x PBS e determine as concentrações medindo OD600 de suspensões bacterianas. Por exemplo, P. aeruginosa com OD600 de 0,5 representa uma concentração de 1 x 108 células bacterianas/mL.
  6. Manche a suspensão bacteriana usando um corante verde ou vermelho fluorescente em RT por 30 minutos com rotação suave no escuro. Para isso, adicione 2 μL do corante concentrado de coloração de estoque concentrado de 500 vezes em 1 mL de suspensão bacteriana para diluir o corante 1 vezes. Para lavar o corante de coloração, centrifugar as bactérias manchadas a 13.000 x g por 2 min e resuspensar a pelota em 1 mL de 1x PBS por três vezes.
    NOTA: Se as bactérias marcadas pela fluorescência (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) forem usadas no experimento, pule esta etapa de coloração bacteriana. GFP-tagged P. aeruginosa e vermelho fluorescente corante manchado L. monocytogenes foram usados neste protocolo.
  7. Coletar as células bacterianas manchadas ou bactérias marcadas por GFP por centrifugação a 13.000 x g por 2 min. Resuspenque em médio F-12K fresco (1 mL) e meça o OD600 de cada cultura. Posteriormente diluir as culturas às concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção (MOI) e concentração de células hospedeiras. O volume final utilizado neste experimento é de 500 μL.
    NOTA: Por exemplo, se a concentração de células hospedeiras contada usando a coloração do Trypan Blue for de 1 x 105 células/mL, a concentração desejada de células bacterianas em um MOI de 100 será de 1 x 107 células/mL. Concentração de P. aeruginosa a 0,5 OD600 é 1 x 108/mL. Para obter a concentração desejada, diluir a cultura P. aeruginosa 10 vezes, adicionar 50 μL de cultura resuspended a 450 μL de médio F-12K fresco.

3. Adesão bacteriana e coloração de células hospedeiras

  1. Primeiro, lave as monocamadas celulares A549 semeadas três vezes com pbs 1x quente. Para cada lavagem, adicione 100 μL de 1x PBS a cada poço, delicadamente pipeta para cima e para baixo três vezes, descarte 1x PBS ou espere por 10 s após a adição e, em seguida, aspirar para remover 1x PBS. Para determinar a cinética da associação bacteriana, sobreponha as células com 100 μL de concentrações desejadas de suspensão bacteriana com diferentes MEIs (0, 1, 10 e 100). Gire as bactérias a 200 x g por 10 minutos e incuba as células A549 infectadas a 37 °C, 5% de CO2 por mais 1h.
    NOTA: Neste experimento, cada condição tinha um triplicado técnico.
  2. Remova as bactérias desvinculadas lavando as monocamadas cinco vezes com 1x de PBS quente, conforme descrito acima. Adicione 100 μL de 4% de formaldeído (em 1x PBS) em cada poço das placas de 96 poços para fixar as células. Deixe as placas sentarem no gelo por 15 minutos e depois lave a solução de fixação usando 1x PBS três vezes.
  3. Para colori-los, adicione 50 ng/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) e incuba-o por 10 min na RT. Após a incubação, lave os poços três vezes usando 1x PBS. Cubra as células A549 infectadas com 100 μL de PBS 1x para evitar a secagem. Processe para a próxima etapa ou armazene a placa a 4 °C por até 2 dias no escuro.

4. Imagem, processamento e análise automatizadas de fluorescência

  1. Para manter a integridade dos dados, escolha aleatoriamente e manualmente cinco locais de cada poço para capturar as imagens com ampliação de 20x. Capture as imagens fluorescentes de células A549 e bactérias sob canais DAPI e GFP, respectivamente. Use o canal PE-Cy5 para as bactérias manchadas pelo corante fluorescente vermelho.
  2. Para ter uma melhor resolução, processe todas as imagens para achatamento de fundo e desconvolução. Defina os parâmetros como 68 μm de diâmetro da bola rolante para suavizar e medir automaticamente a função de propagação de ponto (PSF) da desconvolução de imagem com base no objetivo.
  3. Para contar todas as células e bactérias qualificadas, meça a intensidade de fluorescência das células e bactérias hospedeiras e defina a intensidade de fluorescência mais fraca das células hospedeiras e bactérias como os limiares para a contagem celular. Conte todas as bactérias próximas a uma célula hospedeira a uma distância de 15 μm, pois a bactéria aderente, pois o diâmetro da célula A549 é de 10,59-14,93 μm21.
    NOTA: Uma configuração padrão no sistema de imagem conta seletivamente as células hospedeiras com diâmetros que variam de 5 a 100 μm e bactérias que variam de 0,2-5 μm de tamanho (largura e comprimento).
  4. Com base nos resultados de processamento manual de imagem acima mencionados, aplique os parâmetros de suavização de imagem, desconvolução, tamanhos de objetos, distância e intensidades de fluorescência ao resto das imagens automatizadas. Após a análise automatizada, considere leituras críticas, como contagem total de células hospedeiras, tamanhos e formas das células, contagem total de bactérias e a contagem bacteriana média por célula hospedeira, que foi o indicador mais importante, para determinar a adesão bacteriana.
  5. Exportação de dados e análise estatística
    1. Exportar os resultados analisados de todas as imagens para uma planilha (por exemplo, formato 'xlsx'). O sistema automatizado gera dois conjuntos de resultados: 1) a contagem bacteriana média aderente de cada imagem; 2) os dados informativos de cada célula hospedeira, como bactérias aderentes, contam com uma única célula, tamanho do hospedeiro e a intensidade média de fluorescência de células hospedeiras e bactérias, a partir da imagem correspondente.
    2. Calcule o número médio e o desvio padrão das contagens bacterianas aderentes de todas as imagens para representar o nível de adesão bacteriana em comparação com controles negativos. Neste método, E. coli e B. subtilis serviram como controles negativos no teste de adesão bacteriana Gram-negativa e Gram-positiva, respectivamente. Realize ANOVAs bidireis para testar uma variação significativa entre os pontos de dados em todo o tratamento para três experimentos independentes.

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Representative Results

Para desenvolver o ensaio de adesão bacteriana baseada em imagem de fluorescência, p. aeruginosa cepa PAO1 e sua contraparte de adesão negativa E. coli foram usados para testar a eficácia do protocolo, uma vez que a adesão dessas bactérias às células A549 havia sido relatada14,20,22. Primeiro, a GFP, rotulada P. aeruginosa (PAO1) e E. coli, rotulada por GFP, foram co-incubadas com uma linha de célula epitelial imortalizada humana A549 em vários MOIs, respectivamente. Os resultados mostraram que o PAO1 aderiu às células A549 de forma dependente de dose(Figura 1A,B); Nesse meio tempo, também foi verificada a adesão quase nula de E. coli (Figura 1A,B). Foram 50 imagens capturadas e analisadas em cada MOI. ANOVAs bidireções foram realizadas para testar as variações significativas de três experimentos independentes.

Figure 1
Figura 1: P. aeruginosa bacteriana gram-negativa aderiu às células A549 dentro de 1 h de co-incubação. (A) Imagens microscópicas para uma visão geral da adesão bacteriana onde as imagens foram tiradas usando ampliação de 20x. PAO1 e o controle de adesão negativa E. coli aderiram às células A549 na multiplicidade indicada de infecções (MEIs). As bactérias foram marcadas por gfp-fluorescência. Os núcleos celulares A549 foram manchados pelo DAPI. A barra de escala é de 50 μm. (B) Quantificação da contagem bacteriana aderente por célula A549. Para cada cepa bacteriana testada (PAO1 e E. coli) em cada MOI, foram aplicadas 50 imagens à análise em cada condição. Os dados são ± desvio padrão (SD) de um representante de três experimentos independentes. Foi realizada a análise estatística bidirecional ANOVA. * p < 0,05, *** p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados semelhantes também foram observados quando foram utilizadas bactérias Gram-positivas, L. monocitogens23,24 e seu controle negativo B. subtilis ( Figura2A,B). A adesão às células A549 foi significativa em L. monocytogenes do que B. subtilis (Figura 2A,B).

Figure 2
Figura 2: I. monocytogenes bacterianos gram-positivos aderiram às células A549 dentro de 1 h de co-incubação. (A) Imagens microscópicas para uma visão geral de L. monocytogenes,bem como o controle negativo B. subtilis adesão às células A549 em diferentes MOIs. As bactérias foram manchadas usando um corante vermelho-fluorescente. Os núcleos celulares A549 estavam manchados com DAPI. A barra de escala é de 50 μm. (B) Quantificação da contagem bacteriana aderente por célula A549. Para cada cepa bacteriana testada (L. monocytogenes e B. subtilis) em cada MOI, um total de 50 imagens foram aplicadas à análise em cada condição. Os dados são ± SD de um representante de três experimentos independentes. Foi realizada a análise estatística bidirecional ANOVA. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma imagem representativa da segmentação e contagem de P. aeruginosa aderente ao hospedeiro é mostrada na Figura 3 (Máscaras amarelas: bactérias selecionadas, contorno vermelho: contagem bacteriana única). As configurações para alvos de host e bactérias estão descritas na seção Protocolo.

Figure 3
Figura 3: Exemplo de imagens de segmentação bacteriana e contagem no processo de análise automatizada. (A) Imagens microscópicas de P. aeruginosa aderiram ao A549 em um MOI de 100 sem segmentação e contagem bacteriana. (B) A mesma imagem após a análise estatística da segmentação e contagem bacteriana. Máscaras amarelas: bactérias selecionadas, contorno vermelho: contagem bacteriana única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os resultados das análises automatizadas, incluindo tamanhos e áreas de células hospedeiras, contagem de células bacterianas e hospedeiras, bem como a contagem média de bactérias por célula hospedeira, representando o status de saúde das células hospedeiras, nível de adesão de bactérias e citotoxicidade bacteriana, estão listados na Tabela 1 e Tabela 2. A Tabela 1 representa a contagem bacteriana aderente a um nível celular médio de diferentes imagens, enquanto a Tabela 2 representa contagens bacterianas aderentes analisadas em uma única imagem em um único nível celular A549. Estas imagens representativas foram capturadas de células A549 infectadas por PAO1 em um MOI de 100. Os resultados analisados da imagem inicial na Figura 3 foram listados como Imagem 1 na Tabela 1 e Tabela 2.

Tabela 1: Resultados estatísticos de análise de 9 imagens representativas no nível celular. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Em cada imagem, a contagem de hospedeiros e os pontos de soma bacteriana representam a contagem total de núcleos hospedeiros e contagem total de bactérias reconhecidas pelo sistema com base nos parâmetros descritos acima, respectivamente. Além disso, o cálculo automatizado da razão de manchas bacterianas representa a contagem média de bactérias por célula hospedeira, derivada da contagem de manchas/somas de bactérias. Além disso, leituras adicionais também podem ser incluídas; por exemplo, as contagens de hostntes adeptos de bactérias ilustram o fenômeno universal ou específico da adesão hospedeira-bactérias. Quando a contagem de hospedeiros adeptos de bactérias é muito menor do que a soma do hospedeiro, em contraste, a contagem média de bactérias por hospedeiro é relativamente alta, o que representa que tal fenótipo de adesão tem uma heterogeneidade significativa.

Tabela 2: Análise estatística celular única de uma imagem representativa. Clique aqui para baixar esta Tabela.

A análise celular singular fornece mais detalhes sobre as células hospedeiras e alvos bacterianos em cada imagem, o que é mais útil ao reunir outras características bacterianas e aplicá-las à análise computacional automatizada para desenvolver uma ferramenta mais poderosa na avaliação da potencial patogenicidade bacteriana, como um modelo de Machine Learning que está sendo estudado. Neste protocolo, o tamanho e a área do hospedeiro representam os diâmetros e áreas de cada núcleo hospedeiro manchado, e a intensidade da fluorescência hospedeira representa a intensidade média dos núcleos manchados. A contagem de manchas bacterianas e a área representam os alvos bacterianos adeptos de cada célula hospedeira e suas áreas totais. A intensidade da fluorescência bacteriana representa a intensidade média de todas as bactérias aderentes.

Não surpreende que algumas bactérias virulentas não aderiram ao A549, enquanto algumas bactérias com altos níveis de adesão bacteriana não necessariamente se correlacionam com a patogenicidade. Um tipo diferente de célula hospedeira, HUVECs, também foi testado para maximizar a aplicação deste método. Os resultados mostraram a detecção efetiva e os diferentes fenótipos de adesão das bactérias(Figura 4). Diferentes células hospedeiras poderiam aumentar a estimativa de potenciais patógenos bacterianos; por exemplo, serratiapatogênica rubid aea e Streptococcus agalactiae eram aderentes ao HUVEC, mas não às células A549(Figura 4). Além disso, o citotóxico Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) não foi aderente a A549 ou HUVEC(Figura 4). Portanto, é fundamental garantir que o método seja adequado para vários tipos de células hospedeiras responderem à especificidade das interações hospedeira-bactérias. Ambas as células A549 e HUVEC foram co-incubadas com bactérias em um MOI de 100 a 37 °C por 1 h.

Figure 4
Figura 4: Especificidade da adesão bacteriana às células A549 e HUVEC. As cepas bacterianas, incluindo S. rubidaea, S. agalactiae, citotóxica Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), PAO1, P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP), E. coli, S. aureus e S. aureus ΔsaeR, foram testados em ambas as células A549 e HUVEC em um MOI de 100 para 1 h de co-incubação a 37 °C, 5% CO2. As bactérias estavam manchadas com um corante vermelho-fluorescente. As contagens bacterianas aderentes foram quantificadas a partir de 45 imagens/cepas bacterianas em três experimentos independentes. Os dados são ± SD de um representante de três experimentos independentes. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0.0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo descreve uma abordagem automatizada para enumerar o apego bacteriano às células hospedeiras. A abordagem descrita tem várias vantagens atraentes em relação aos métodos convencionais. Em primeiro lugar, essa abordagem permite a quantificação precisa do número de células de patógenos microbianas que estão ligadas a células hospedeiras individuais. É importante ressaltar que essa quantificação pode ser realizada sem a necessidade de colheita bacteriana laboriosa, diluições seriais, revestimento em mídia sólida e determinação das UFC10,11,12. Como tal, a técnica descrita reduz a carga de trabalho global necessária para quantificar a adesão bacteriana. Deve-se apreciar que as vantagens da abordagem proposta sejam amplificadas ao buscar detectar fenótipos de adesão em experimentos de triagem em larga escala, incluindo a identificação de genes bacterianos ou hospedeiros em bibliotecas mutantes ou CRISPR, respectivamente, que regulam esse processo. Em segundo lugar, a avaliação direta das interações entre células hospedeiras e bacterianas utilizando microscopia de fluorescência fornece informações para mecanismos elucidadores de patogenicidade bacteriana, incluindo alterações em uma sobrevivência de células hospedeiras ou bacterianas, morfologia ou dinâmica. Finalmente, a análise estatística automatizada realizada em imagens coletadas na análise não apenas fornece uma quantificação global da associação bacteriana média com células hospedeiras, mas também permite a avaliação de interações dinâmicas, unicelulares, hogógenos.

Apesar dessas vantagens, os métodos descritos têm algumas limitações importantes. Em primeiro lugar, a coloração de fluorescência de bactérias é necessária para enumerar sua adesão às células hospedeiras. Assim, o corante de coloração fluorescente tem que manchar seletivamente bactérias do que suas contrapartes celulares hospedeiras. Além disso, o corante de coloração não deve alterar o fenótipo de fixação das bactérias que o carregam. Portanto, a otimização da coloração da fluorescência bacteriana (por exemplo, concentração, duração da coloração) deve ser determinada antes da realização dos estudos de adesão descritos. Neste protocolo, a coloração fluorescente de cepas bacterianas, incluindo P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli e B. subtilis por 30 min, não afeta sua adesão às células hospedeiras. Em segundo lugar, devido à especificidade de diferentes interações hospedeira-bactéria, um único tipo de célula hospedeira pode não ser suficiente para avaliar o apego bacteriano às células hospedeiras. Portanto, vários tipos de células hospedeiras podem ser necessários para obter uma compreensão completa do grau em que um determinado micróbio pode aderir às superfícies das células hospedeiras. Em terceiro lugar, a segmentação bacteriana não foi totalmente eficiente quando as bactérias impulsionam a agregação durante a co-incubação, por exemplo, S. aureus, ou quando as bactérias formaram aglomerados em um MOI mais alto (>100), por exemplo, P. aeruginosa. Neste caso, uma ampliação maior deve ser aplicada para capturar as imagens, ou mais imagens devem ser usadas na análise para reduzir o efeito da agregação bacteriana.

As células epiteliais pulmonares humanas (A549) e HUVECs foram empregadas nos estudos para demonstrar a plasticidade da abordagem em relação ao tipo de célula hospedeira, e ambas apresentaram altos níveis de suscetibilidade à adesão bacteriana. O uso de dois tipos de células hospedeiras também demonstrou que o método descrito poderia ser amplamente aplicado para caracterizar as interações aderentes entre hospedeiros-bactéria rapidamente.

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Disclosures

Todos os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Somos gratos ao Dr. Kaite Zlotkowski da Biotek Inc. por seu suporte técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Defesa sob o número do contrato W911NF1920013 para a PdF, a Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa (DARPA) e o Departamento do Interior sob o contrato nº 140D6319C0029 ao PdF. O conteúdo das informações não reflete necessariamente a posição ou a política do Governo, e nenhum endosso oficial deve ser inferido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Imunologia e Infecção Problema 175

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Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

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Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras
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Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

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