Summary

Оптимизация установки и условий для электроретинограммы Ex Vivo для изучения функции сетчатки в маленьких и больших глазах

Published: June 27, 2022
doi:

Summary

Модификация существующего многоэлектродного массива или патч-зажимного оборудования делает электроретинограмму ex vivo более доступной. Улучшенные методы регистрации и поддержания световых реакций ex vivo облегчают изучение функции фоторецепторов и ON-биполярных клеток в здоровой сетчатке, животных моделей глазных заболеваний и донорской сетчатки человека.

Abstract

Измерения световых реакций нейронов сетчатки имеют решающее значение для исследования физиологии здоровой сетчатки, определения патологических изменений при заболеваниях сетчатки и тестирования терапевтических вмешательств. Электроретинограмма ex vivo (ERG) позволяет количественно оценить вклад отдельных типов клеток в изолированной сетчатке путем добавления специфических фармакологических агентов и оценки тканевых изменений независимо от системных воздействий. Световые реакции сетчатки могут быть измерены с помощью специализированного держателя образца ex vivo ERG и записывающей установки, модифицированной из существующего зажима патча или микроэлектродного массива. В частности, изучение ON-биполярных клеток, а также фоторецепторов было затруднено медленным, но прогрессирующим снижением световых реакций в EX VIVO ERG с течением времени. Повышенная скорость перфузии и регулировка температуры перфузата улучшают функцию сетчатки ex vivo и максимизируют амплитуду и стабильность отклика. Ex vivo ERG уникально позволяет изучать отдельные типы нейрональных клеток сетчатки. Кроме того, улучшения для максимизации амплитуд отклика и стабильности позволяют исследовать световые реакции в образцах сетчатки от крупных животных, а также в глазах доноров человека, что делает ex vivo ERG ценным дополнением к репертуару методов, используемых для исследования функции сетчатки.

Introduction

Электроретинография измеряет функцию сетчатки в ответ на свет1. Это неотъемлемая часть изучения физиологии и патофизиологии сетчатки, а также измерения успеха терапии заболеваний сетчатки. In vivo ERG широко используется для оценки функции сетчатки у интактных организмов, но имеет значительные ограничения 2,3. Среди них количественный анализ отдельных типов клеток сетчатки в IN VIVO ERG затруднен, поскольку он регистрирует сумму потенциальных изменений и, следовательно, наложение ответов от всех клеток сетчатки к световым стимулам4. Кроме того, он не позволяет добавлять лекарства к сетчатке, уязвим к системным воздействиям и имеет относительно низкое отношение сигнал/шум. Эти недостатки устраняются в ex vivo ERG, который исследует функцию изолированной сетчатки 2,3,5,6. EX vivo ERG позволяет регистрировать большие и стабильные ответы от конкретных типов клеток сетчатки путем добавления фармакологических ингибиторов и легкой оценки терапевтических агентов, которые могут быть добавлены к суперфузату. В то же время он устраняет влияние системных эффектов и устраняет физиологический шум (например, сердцебиение или дыхание).

В EX VIVO ERG сетчатку или образцы сетчатки изолируют и устанавливают фоторецепторной стороной вверх на куполе держателя образца 3,5. Держатель образца собирается, подключается к перфузионной системе, которая снабжает сетчатку нагретой, насыщенной кислородом средой, и помещается на сцену микроскопа, который был модифицирован для доставки управляемых компьютером световых стимулов. Для записи откликов, вызванных светом, держатель образца подключается к усилителю, дигитайзеру и системе записи (рисунок 1). Этот метод позволяет выделить ответы от палочковых и колбочек фоторецепторов, ON-биполярных клеток и глии Мюллера путем изменения параметров световых раздражителей и добавления фармакологических агентов.

Существующий зажим или многоэлектродный массив (MEA) может быть преобразован для записи ex vivo ERG либо в сочетании с коммерчески доступным адаптером ex vivo ERG, либо с пользовательским поликарбонатным держателем для образцов с числовым программным управлением (ЧПУ) для измерения световых реакций в сетчатке от моделей мелких животных, таких как мыши. Данная модификация повышает доступность ex vivo ERG при минимизации потребности в специализированном оборудовании. Конструкция держателя образца упрощает технику монтажа и интегрирует электроды, устраняя необходимость манипуляций с микроэлектродами по сравнению с ранее сообщенными трансретинальными методами ex vivo ERG7. Скорость перфузии и температура внутри держателя образца являются важными факторами, которые влияют на свойства ответа фоторецепторов и ON-биполярных клеток. Регулируя эти условия, EX VIVO ERG может быть надежно зарегистрирован из изолированной сетчатки мыши в течение длительных периодов времени. Оптимизированные экспериментальные условия позволяют записывать EX VIVO ERG в удары сетчатки от более крупных сетчаток, включая большие глаза животных и глаза донора человека8.

Protocol

Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по изучению животных в Университете штата Юта. Глаза свиней для демонстрации этого видео были получены пос?…

Representative Results

Ex vivo ERG позволяет регистрировать воспроизводимые и стабильные световые реакции фоторецепторов и ON-биполярных клеток, например, от сетчатки мыши (рисунок 2A-C). Регистрация реакций фоторецепторов от донорской сетчатки человека возможна при посмерт?…

Discussion

Первоначально разработанный в 1865 году Холмгреном для измерения световых реакций сетчатки от амфибиисетчатки 10, технические ограничения первоначально препятствовали широкому использованию ERG. Тем не менее, основополагающие исследования Рагнара Гранита и других выявили ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национального института глаз EY02665 и EY031706 и Международным фондом исследований сетчатки доктору Винбергу, основным грантом Национальных институтов здравоохранения (EY014800) и неограниченным грантом от исследований по предотвращению слепоты, Нью-Йорк, нью-йорк, департаменту офтальмологии и визуальных наук Университета штата Юта. Д-р Франс Винберг также является лауреатом исследования по предотвращению слепоты / Dr. H. James and Carole Free Career Development Award, а д-р Силке Беккер – гранта ARVO EyeFind. Мы благодарим д-ра Энн Ханнекен из Научно-исследовательского института Скриппса за предоставление донорского глаза, используемого для записей, показанных на рисунке 2E.

Materials

2 mm socket WPI 2026-10 materials to prepare electrode
Ag/AgCl Electrode World Precision Instruments EP1 materials to prepare electrode
Ames' medium Sigma Aldrich A1420 perfusion media
barium chloride Sigma Aldrich B0750 potassium channel blocker
DL-AP4 Tocris 0101 broad spectrum glutamatergic antagonist
OcuScience Ex Vivo ERG Adapter OcuScience n/a ex vivo ERG specimen holder
Threaded luer connector McMaster-Carr 51525K222 or 51525K223 materials to prepare electrode

References

  1. Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
  2. Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
  3. Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
  5. Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
  6. Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
  7. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
  8. Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
  9. Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
  10. Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
  11. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
  12. Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
  13. Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
  14. Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
  15. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
  16. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
  17. Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
  18. Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
  19. Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).

Play Video

Cite This Article
Abbas, F., Vinberg, F., Becker, S. Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes. J. Vis. Exp. (184), e62763, doi:10.3791/62763 (2022).

View Video