Optimera installationen och förutsättningarna för ex vivo-elektroretinogram för att studera näthinnans funktion i små och stora ögon
Summary
Modifiering av befintlig multielektrodmatris eller patchklämutrustning gör ex vivo-elektroretinogrammet mer allmänt tillgängligt. Förbättrade metoder för att registrera och upprätthålla ex vivo-ljussvar underlättar studien av fotoreceptor- och ON-bipolär cellfunktion i den friska näthinnan, djurmodeller av ögonsjukdomar och mänskliga donatornäthinnor.
Abstract
Mätningar av retinala neuronala ljussvar är avgörande för att undersöka fysiologin hos den friska näthinnan, bestämma patologiska förändringar i näthinnesjukdomar och testa terapeutiska ingrepp. Ex vivo-elektroretinogrammet (ERG) möjliggör kvantifiering av bidrag från enskilda celltyper i den isolerade näthinnan genom tillsats av specifika farmakologiska medel och utvärdering av vävnadsinneboende förändringar oberoende av systemiska influenser. Retinala ljussvar kan mätas med hjälp av en specialiserad ex vivo ERG-provhållare och inspelningsinställning, modifierad från befintlig patchklämma eller mikroelektrodmatrisutrustning. Särskilt har studien av ON-bipolära celler, men också av fotoreceptorer, hindrats av den långsamma men progressiva nedgången av ljussvar i ex vivo ERG över tid. Ökad perfusionshastighet och justering av perfusattemperaturen förbättrar ex vivo retinal funktion och maximerar responsamplituden och stabiliteten. Ex vivo ERG möjliggör unikt studier av individuella retinala neuronala celltyper. Dessutom möjliggör förbättringar för att maximera responsamplituder och stabilitet undersökning av ljussvar i näthinneprover från stora djur, såväl som mänskliga donatorögon, vilket gör ex vivo ERG till ett värdefullt tillskott till repertoaren av tekniker som används för att undersöka retinal funktion.
Introduction
Elektroretinografi mäter retinal funktion som svar på ljus1. Det är en integrerad del av att studera retinal fysiologi och patofysiologi och mäta framgången för terapier för retinala sjukdomar. ERG in vivo används ofta för att bedöma retinal funktion i intakta organismer, men den har betydande begränsningar 2,3. Bland dessa hindras den kvantitativa analysen av enskilda retinala celltyper i in vivo ERG, eftersom den registrerar summan av potentiella förändringar, och därmed överlagringssvar, från alla retinala celler till ljusstimuli4. Dessutom tillåter det inte lätt tillsats av läkemedel till näthinnan, är sårbart för systemiska influenser och har ett relativt lågt signal-brusförhållande. Dessa nackdelar elimineras i ex vivo ERG som undersöker funktionen hos den isolerade näthinnan 2,3,5,6. Ex vivo ERG möjliggör registrering av stora och stabila svar från specifika retinala celltyper genom tillsats av farmakologiska hämmare och enkel utvärdering av terapeutiska medel, som kan tillsättas superfusatet. Samtidigt tar det bort påverkan av systemiska effekter och eliminerar fysiologiskt brus (t.ex. hjärtslag eller andning).
I ERG ex vivo isoleras näthinnor eller näthinneprover och monteras fotoreceptorsidan uppåt på kupolen på provhållaren 3,5. Provhållaren är monterad, ansluten till ett perfusionssystem som förser näthinnan med uppvärmda, syresatta medier och placeras på scenen i ett mikroskop, som har modifierats för att leverera datorstyrda ljusstimuli. För att registrera svaren som framkallas av ljus är provhållaren ansluten till ett förstärkare, digitaliserare och inspelningssystem (figur 1). Denna teknik möjliggör isolering av svar från stav- och konfotoreceptorer, ON-bipolära celler och Müller glia genom att ändra parametrarna för ljusstimuli och tillsätta farmakologiska medel.
En befintlig patchklämma eller multielektroduppsättning (MEA) kan konverteras för att spela in ex vivo ERG, antingen i kombination med en kommersiellt tillgänglig ex vivo ERG-adapter eller en anpassad polykarbonatdator numerisk kontroll (CNC) -bearbetad provhållare, för att mäta ljussvar i näthinnor från små djurmodeller, såsom möss. Denna modifiering ökar tillgängligheten för ex vivo ERG samtidigt som behovet av specialutrustning minimeras. Provhållarens konstruktion förenklar monteringstekniken och integrerar elektroder, vilket eliminerar behovet av manipulation av mikroelektroder jämfört med tidigare rapporterade transretinala ex vivo ERG-metoder7. Perfusionshastigheten och temperaturen inuti provhållaren är viktiga faktorer som påverkar responsegenskaperna från fotoreceptorer och ON-bipolära celler. Genom att justera dessa förhållanden kan ex vivo ERG registreras på ett tillförlitligt sätt från den isolerade musnäthinnan under längre tidsperioder. Optimerade experimentella förhållanden möjliggör ex vivo ERG-inspelningar i retinala stansar från större näthinnor, inklusive stora djurögon och mänskliga donatorögon8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ursprungligen utvecklad 1865 av Holmgren för att mäta retinala ljussvar från amfibienäthinnan10, hindrade tekniska begränsningar initialt ERG från att användas i stor utsträckning. Icke desto mindre identifierade seminalstudier av Ragnar Granit och andra det cellulära ursprunget till ERG och mätte fotoreceptor- och ON-bipolära cellsvar ex vivo11,12,13. Sedan dess har förfinade metoder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Eye Institute-bidrag EY02665 och EY031706 och International Retinal Research Foundation till Dr. Vinberg, National Institutes of Health Core Grant (EY014800), och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness, New York, NY, till Institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper, University of Utah. Dr. Frans Vinberg är också mottagare av ett Research to Prevent Blindness/Dr. H. James och Carole Free Career Development Award, och Dr. Silke Becker av ett ARVO EyeFind-stipendium. Vi tackar Dr. Anne Hanneken från The Scripps Research Institute för att ha tillhandahållit donatorögat som används för inspelningar som visas i figur 2E.
Materials
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Perlman, I., Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina–a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
