活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

小型，自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种简单而强大的模式生物，用于解决广泛的生物学问题。自1963年引入以来，线虫对于回答神经生物学，新陈代谢，衰老，发育，免疫和遗传学方面的问题非常宝贵¹。该动物的许多特征使其成为理想的模式生物，包括较短的生成时间，RNA干扰的有效性，透明的身体以及其细胞谱系和神经系统的完整图谱。

虽然线虫对科学的贡献是巨大的，但它们在阐明真核转录系统方面没有得到充分利用，我们对这些机制的大部分理解来自使用酵母，果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物^的研究2。阻止研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质层、糖蛋白和脂质组成，使秀丽隐杆线虫从幼虫期到成年期都耐通过化学或机械力提取蛋白质³。使用秀丽隐杆线虫核提取物的体外转录系统曾经开发出来，但由于系统范围有限，未被广泛采用，使用Dounce均质机制备提取物可能导致蛋白质不稳定^4，5。

与先前利用Dounce均质机破坏 秀丽隐杆线虫 的核提取物分离协议不同，该协议使用Balch均质机。Balch均质机由两个主要部件组成：一个碳化钨球和一个不锈钢块，其通道从一端钻到另一端。Balch均质机装有碳化钨球，并在两侧盖上盖子以密封研磨室。注射器可以装载在通往研磨室的两个垂直端口上。当材料通过研磨室从一个注射器传递到另一个注射器时，来自注射器的压力迫使材料通过球和腔室壁之间的狭窄间隙。这种缓慢而恒定的压力会破坏材料，直到它达到能够轻松穿过狭窄间隙的一致尺寸。通过恒定而温和的压力迫使 秀丽隐杆线虫 穿过狭窄的间隙，使动物打开，将它们的内容释放到周围的缓冲区中。切换球的大小进一步收紧间隙，破坏新释放的细胞并将细胞核释放到缓冲液中。多次离心将细胞核与其余的细胞碎片分开，从而可以收集干净的核提取物。Balch均质机优于Dounce均质机，原因如下：该系统可以处理大量动物，从而可以在一次尝试中提取大量活性蛋白;滚珠和钢块的精确加工允许在多个样品之间进行一致的磨削;重型钢块充当散热器，均匀地将热量从研磨室中吸走，防止变性。

分离后，核提取物转录活性必须在用于任何生化实验之前进行验证。传统上，使用放射性标记的核苷酸来测量转录活性，以跟踪和可视化新合成的RNA。然而，放射性标签可能很繁琐，因为它在使用和处置过程中需要采取预防措施⁶。技术进步使今天的研究人员能够使用危害性更小或麻烦得多的方法，使用定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）⁷等技术来测量即使是很小的RNA量。在这里，该协议描述了一种从幼虫4期（L4） 秀丽隐杆线虫 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的方法。