Summary

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

Published: May 06, 2021
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Summary

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Abstract

As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.

Introduction

O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. Portanto, desenvolver novas fontes de hepatócitos humanos funcionais é uma importante direção de pesquisa no campo da medicina regenerativa. Desde 1998, quando foram estabelecidos4,os hESCs têm sido amplamente considerados pelos pesquisadores devido ao seu potencial de diferenciação superior (eles podem se diferenciar em vários tecidos em um ambiente adequado) e alto grau de autoconexibilidade, e assim fornecer células de origem ideais para fígados bioartificial, transplante de hepatocito e até mesmo engenharia de tecido hepático5.

Atualmente, a eficiência de diferenciação hepática pode ser muito aumentada enriquecendo o endodermo6. Na diferenciação de linhagem das células-tronco em endoderme, os níveis do fator de crescimento transformador β (TGF-β) sinalização e vias de sinalização WNT são os fatores-chave no nó do estágio de formação do endoderme. A ativação de um alto nível de sinalização TGF-β e WNT pode promover o desenvolvimento do endodermo7,8. Activin A é uma citocina pertencente à superfamília TGF-β. Portanto, a Activin A é amplamente utilizada na indução de endoderme de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e hESCs9,10. GSK3 é uma proteína de serina-threonina quinase. Pesquisadores descobriram que o CHIR99021, um inibidor específico do GSK3β, pode estimular sinais típicos de WNT, e pode promover a diferenciação de células-tronco sob certas condições, sugerindo que o CHIR99021 tem potencial para induzir a diferenciação de células-tronco no endóderme 11,12,13.

Aqui relatamos um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação dos hESCs em HLCs funcionais. A adição sequencial de Activin A e CHIR99021 produziu cerca de 89,7±0,8% de células SOX17 (marcador DE)positivos. Após serem ainda mais maturadas in vitro,essas células expressaram marcadores específicos hepáticos e exerceram morfologia semelhante a hepatocito (baseada na coloração de hematoxilina-eosina (H & E)) e funções, como absorção de verde indociina (ICG), armazenamento de glicogênio e atividade CYP3. Os resultados mostram que os hESCs podem ser diferenciados com sucesso em HLCs funcionais maduros por este método e podem fornecer uma base para pesquisas relacionadas a doenças hepáticas e triagem de medicamentos in vitro.

Protocol

1. Manutenção de células-tronco NOTA: O protocolo de manutenção celular descrito abaixo se aplica à linha de células hES03 mantida em uma monocamada aderente. Para todos os protocolos a seguir neste manuscrito, as células devem ser manuseadas sob um gabinete de segurança biológica. Prepare o meio de cultura de células-tronco 1x mTesR diluindo 5x meio suplementar para mTesR meio básico. Prepare o meio Matrigel qualificado em 30x hESC diluindo 5 mL de Matrigel qua…

Representative Results

O diagrama esquemático da indução de HLC de hESCs e imagens representativas de campo brilhante de cada estágio de diferenciação são mostrados na Figura 1. No Estágio I, Activin A e CHIR99021 foram adicionados por 3 dias para induzir células-tronco a formar células de endoderme. No Estágio II, as células de endoderme se diferenciaram em células progenitoras hepáticas após serem tratadas com meio de diferenciação por 5 dias. Na Fase III, os hepatócitos precoces amadureceram e…

Discussion

Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.

As seguintes etapas críticas devem ser levadas em …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

References

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Cite This Article
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

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