Dieser Artikel stellt eine detaillierte Methodik zur Messung von Isolevuglandinen in Geweben durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von alkalischen Phosphatase-konjugierten ScFv D11-Antikörpern vor. Bluthochdruckmodelle sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen werden verwendet, um die Schritt-für-Schritt-Verfahren und grundlegenden Prinzipien der Isolevuglandin-Messung in Gewebeproben zu erklären.
Isolevuglandine (IsoLGs) sind hochreaktive Gamma-Ketoaldehyde, die aus H2-Isoprostanen durch Lipidperoxidation gebildet werden und Proteine vernetzen, was zu Entzündungen und verschiedenen Krankheiten wie Bluthochdruck führt. Der Nachweis der IsoLG-Akkumulation im Gewebe ist entscheidend, um Licht auf ihre Beteiligung an den Krankheitsprozessen zu werfen. Die Messung von IsoLGs in Geweben ist jedoch äußerst schwierig, und die derzeit verfügbaren Werkzeuge, einschließlich der Massenspektrometrie, sind mühsam und extrem teuer. In dieser Arbeit beschreiben wir eine neue Methode zum in situ Nachweis von IsoLGs in Geweben unter Verwendung von alkalischer Phosphatase-konjugiertem D11 ScFv und einem rekombinanten Phagen-Display-Antikörper, der in E. coli durch Immunfluoreszenzmikroskopie hergestellt wurde. Zur Validierung der Färbung wurden vier Kontrollen verwendet: (1) Färbung mit und ohne D11, (2) Färbung mit bakteriellem periplasmatischem Extrakt mit dem alkalischen Phosphatase-Linker, (3) irrelevante scFV-Antikörperfärbung und (4) Konkurrenzkontrolle mit IsoLG vor der Färbung. Wir zeigen die Wirksamkeit der alkalischen Phosphatase-konjugierten D11 sowohl in humanen als auch in Mausgeweben mit oder ohne Hypertonie. Diese Methode wird wahrscheinlich als wichtiges Werkzeug dienen, um die Rolle von IsoLGs in einer Vielzahl von Krankheitsprozessen zu untersuchen.
Isolevuglandine (IsoLGs), auch Isoketale genannt, sind Isomere aus der Familie der 4-Ketoaldehyde, die Produkte der Lipidperoxidation sind und mit primären Aminen auf Proteine 1,2 reagieren und diese adduktieren. IsoLGs werden mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Herz-Kreislauf-, Alzheimer-, Lungen- und Lebererkrankungen sowie viele Krebsarten3. IsoLGs wurden am ausführlichsten in ihrem Beitrag zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht, die weltweit, einschließlich der Vereinigten Staaten, eine erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Belastung darstellen. Es wird geschätzt, dass 92,1 Millionen Erwachsene in den USA mindestens eine Art von Herz-Kreislauf-Erkrankungen haben, wobei die geschätzten Prognosen für 2030 43,9 % der erwachsenen US-Bevölkerung erreichen4. Die Senkung des Blutdrucks, des Cholesterinspiegels und der Raucherentwöhnung verringert das Gesamtrisiko und das Auftreten von kardiovaskulären Ereignissen5.
Bluthochdruck oder Hypertonie ist ein Hauptrisikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und betrifft etwa die Hälfte der US-Bevölkerung6. Frühere Studien haben ergeben, dass Entzündungen eine zugrunde liegende Ursache für Bluthochdruck sind und dass IsoLGs eine Rolle spielen7. Hypertensive Stimuli, einschließlich Angiotensin II, Katecholamine, Aldosteron und überschüssiges Nahrungssalz, induzieren eine IsoLG-Akkumulation in antigenpräsentierenden Zellen, einschließlich dendritischer Zellen (DCs), die wiederum T-Zellen aktivieren, um sich zu vermehren und entzündliche Zytokine zu produzieren, die zu Bluthochdruck beitragen 8,9.
Zuvor wurden IsoLGs mittels Immunhistochemie, Massenspektrometrie, Enzyme-linked Immunosorbent Assay und Durchflusszytometrie gemessen10,11. Um die Messung von IsoLGs zu erleichtern, wurde ein rekombinanter Antikörper (D11) gegen IsoLGs12 entwickelt. Ursprünglich enthielt dieser D11-Antikörper einen 11-Aminosäure-E-Tag und benötigte einen sekundären Antikörper für den immunhistochemischen Nachweis11. Es war jedoch schwierig, einen zuverlässigen Sekundärantikörper gegen den E-Tag zu finden, nachdem die Produktion durch den Hersteller eingestellt wurde. Daher haben wir ein zuverlässiges Protokoll für die Immunfluoreszenzfärbung von IsoLGs unter Verwendung von D11 konjugiert mit alkalischer Phosphatase (D11-AP) entwickelt, das wir in Maus- und menschlichen Geweben mit und ohne Bluthochdruck nachgewiesen haben.
D11 wurde ausgiebig verwendet, um IsoLG-adduzierte Proteine in Zellen oder Geweben als Marker für Entzündungen oder oxidativen Stress bei der Krankheit 8,9,20 nachzuweisen. Zuvor enthielt D11 einen E-Tag, und die IHC-Entwicklung erforderte die Verwendung eines sekundären Anti-E-Tag-Antikörpers, der mit HRP 10,20,21 konjugiert war. Hier haben wir ein Protokoll für den Nachweis von IsoLG-adduzierten Proteinen entwickelt und optimiert, wobei der D11-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, anstelle des E-Tags konjugiert ist, wodurch eine sekundäre Antikörperinkubation entfällt.
Um die Spezifität von D11-AP zu bestimmen, wurden vier Negativkontrollexperimente durchgeführt. Wir haben das Protokoll ohne das Vorhandensein von D11 durchgeführt und hatten nur minimale Entwicklung. Diese Ergebnisse haben einen zweifachen Hinweis: Die endogene alkalische Phosphatase trägt nicht zur Entwicklung bei, und die beobachtete Färbung ist auf D11 zurückzuführen und nicht auf einen anderen beitragenden Faktor. Als nächstes färbten wir Objektträger mit dem AP-Linker ohne D11. Dieses Experiment führte zu einer geringen Färbung, was darauf hindeutet, dass freie AP oder andere Faktoren im periplasmatischen Extrakt nicht die Färbung verursachen, die wir in Gegenwart von D11 beobachten. Um die Spezifität von D11 gegenüber IsoLG zu gewährleisten, haben wir D11-AP vor der Färbung von Objektträgern mit gereinigtem IsoLG vorinkubiert. Wir sahen eine Abnahme der Entwicklung, was darauf hindeutet, dass das D11-AP an das IsoLG-Protein gebunden war, wodurch die Menge an freiem D11-AP erschöpft war, um an IsoLG im Gewebe zu binden. Um sicherzustellen, dass D11-AP an IsoLG und nicht an das MSA-Protein bindet, an das IsoLG gebunden ist, haben wir D11-AP nur mit MSA vorinkubiert. Es gab keine Veränderungen in der Entwicklung, was darauf hindeutet, dass D11-AP nicht an MSA, sondern an das IsoLG-Protein bindet. Schließlich waren die Forscher, die das Färbeprotokoll entwickelten, blind für den hypertensiven Status des menschlichen Darmgewebes. Die Unterschiede in der Färbung, die zwischen Patienten mit Hypertonie und Patienten mit Normotension beobachtet wurden, waren nicht auf Bias zurückzuführen und wurden bereits beschrieben22,23.
Obwohl unser Protokoll zum Nachweis von IsoLG-adduzierten Proteinen unter Verwendung des D11-Antikörpers, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, anstelle des E-Tags streng und robust ist und die Notwendigkeit einer sekundären Antikörperinkubation überflüssig macht, weist es einige Einschränkungen auf. Eine Einschränkung besteht darin, dass wir D11 konjugiert mit alkalischer Phosphatase im periplasmatischen Extrakt verwendet haben, und es könnte zu einer falschen Färbung der endogenen alkalischen Phosphatase im periplasmatischen Extrakt oder in bestimmten Geweben, wie z. B. Darm24, kommen. Der erste Schritt zur Entwicklung dieses Protokolls bestand jedoch darin, die endogene alkalische Phosphatase, die in Geweben vorhanden sein kann, zu deaktivieren25. Zunächst wurden kalte Essigsäure, BME und Levamisol26 auf ihre Wirksamkeit getestet. Keiner dieser Faktoren verringerte das Vorhandensein der aktiven endogenen alkalischen Phosphatase vollständig. Hitze wurde verwendet, um die alkalische Phosphatase27 zu deaktivieren, daher haben wir die Hitzedeaktivierung der alkalischen Phosphatase in verschiedenen Puffern getestet. Wir fanden heraus, dass das Erhitzen von montierten und hydratisierten Objektträgern in Citratpuffer den größten Teil der endogenen alkalischen Phosphatase eliminierte. Objektträger wurden ursprünglich mit einem Chemilumineszenz-/Fluoreszenzsubstrat entwickelt, aber wenn sie ohne dieses Substrat abgebildet wurden, gab es eine hohe Menge an Autofluoreszenz. VectorRed ist ein Substrat, das sich in Gegenwart alkalischer Phosphatase zu einem Chromogen entwickelt, das im Texas Red/TRITC-Kanalbereich sichtbar gemacht werden kann. Mit diesem Substrat konnten wir das Signal oberhalb der Hintergrundautofluoreszenz leichter beobachten. Während des Färbevorgangs sollte darauf geachtet werden, dass die künstliche Färbung minimiert wird. Trocknung des Gewebes auf Objektträgern nach der Hydratation, bis die Bildgebung zu einer verstärkten Entwicklung geführt hat. D11-AP sollte aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Mehrfaches Einfrieren und Auftauen sollte bei der Arbeit mit D11-AP vermieden werden. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) kann auch die enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase beeinflussen und sollte nicht als Waschpuffer verwendet werden28. Wie bei jedem antikörperbasierten Ansatz müssen gründliche Tests und Optimierungen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Färbung spezifisch ist und das Signal nicht über- oder unterverstärkt wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein leistungsstarkes, rigoroses und robustes, optimiertes Protokoll zum Nachweis von IsoLG-adduzierten Proteinen entwickelt haben, wobei der D11-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert ist, anstelle des E-Tags konjugiert wird. Dieses Protokoll bietet mehrere Vorteile: Erstens ist die Verwendung von D11 als alkalisches Phosphatase-Fusionsprotein billiger. D11 wurde ursprünglich aus einer Phagen-Antikörper-Bibliothek gewonnen, die nicht kommerzialisiert werden konnte und teuer in der Reinigung war. Obwohl D11 im periplasmatischen Extrakt von E. coli eine kostengünstige Alternative darstellen könnte, war es in den meisten Assays unwirksam. Zweitens ermöglicht der Ansatz der alkalischen Phosphatase-Fusion, dass D11 scfv mit einem nützlichen Reporter15 (alkalische Phosphatase) fusioniert wird und für die Verwendung in Immunoassays nicht gereinigt werden müsste, da Substrate kommerziell verfügbar sind. Drittens bildet die alkalische Phosphatase von E. coli Dimere29. D11 würde also, wenn es mit der alkalischen Phosphatase fusioniert wird, auch Dimere bilden, was die Avidität und Bindungsaktivität des Antikörpers erhöht30. Schließlich kann D11, das mit alkalischer Phosphatase in periplasmatischem Extrakt konjugiert ist, leicht mit Cibacron Blue Sepharose gereinigt werden. D11 hat einen hohen isoelektrischen Punkt (~9,2 pH). Als solches ist es positiv geladen und kann durch pi-kation-Wechselwirkungen an Cibacron Blue binden. Die meisten Verunreinigungen im periplasmatischen Extrakt von E. coli können vom Harz eluiert werden. Das mit alkalischer Phosphatase konjugierte D11 kann dann mit hohem Salzgehalt (~1,5M NaCl) in Wasser eluiert werden. Das eluierte D11, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, ist bei 4-8 °C in der Hochsalzlösung recht stabil. Daher haben wir ein Protokoll entwickelt, das nicht nur den D11-Antikörper kostengünstig verfügbar macht, sondern auch die zusätzlichen Schritte und die Notwendigkeit der Inkubation des Sekundärantikörpers eliminiert. Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Messung von IsoLGs, die sich in Geweben bei mehreren Krankheiten anreichern, bei denen erhöhter oxidativer Stress eine Rolle spielt.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 und R03HL155041 an A.K. unterstützt. Wir danken der Digital Histology Shared Resource – Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 für die Visualisierung und das Scannen von Objektträgern.
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) | Cytiva | 28953766 | |
200 Proof Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
2xYT powder | MP Biomedicals | 3012-032 | |
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates | ThermoFisher (NUNC) | 242757 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) | Carbosynth | EN08508 | |
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) | Carbosynth | EB09335 | |
Ampicillin, sodium salt | Research Products International (RPI) | A40040 | |
Bovine Serum Albumin | RPI | A30075 | |
Chemically competent TG1 E. coli | Amid Biosciences | TG1-201 | |
Diethanolamine, >98% | Sigma-Aldrich | D8885 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Mouting medium |
Glucose | Research Products International (RPI) | G32045 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | Xylene alternative |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock solution = 10 mg/mL |
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals | ThermoFisher | MK-2624-212 | |
Imidazole | Research Products International (RPI) | I52000 | |
MgCl2 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Mouse Serum Albumin (MSA) | Sigma-Aldrich/Calbiochem | 126674 | |
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Carbosynth | EN13587 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
Pressure Cooker | Cuisinart | CPC-600 | |
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml | ThermoFisher | 66380 | |
Sodium chloride (NaCl) | Research Products International (RPI) | S23020 | |
Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | 1064461000 | |
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Research Products International (RPI) | S23100 | |
Sucrose | Research Products International (RPI) | S24065 | |
Tris base | Research Products International (RPI) | T60040 | |
Tris-buffered Saline | Boston Bio-Products | 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4 | |
Tris-HCl | Research Products International (RPI) | T60050 | |
Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Vector Red | Vector Labs | SK-5105 |