Summary

Chirurgie et traitement des échantillons pour l’imagerie corrélative de la valve pulmonaire murine

Published: August 05, 2021
doi:

Summary

Ici, nous décrivons un flux de travail corrélatif pour l’excision, la pressurisation, la fixation et l’imagerie de la valve pulmonaire murine afin de déterminer la conformation grossière et les structures de la matrice extracellulaire locale.

Abstract

Les causes sous-jacentes de la maladie liée aux valves cardiaques (HVD) sont insaisissables. Les modèles animaux murins fournissent un excellent outil pour étudier le HVD, mais l’expertise chirurgicale et instrumentale requise pour quantifier avec précision la structure et l’organisation sur plusieurs échelles de longueur a retardé son avancement. Ce travail fournit une description détaillée de la dissection murine, de la coloration en bloc, du traitement des échantillons et des procédures d’imagerie corrélative pour représenter la valve cardiaque à différentes échelles de longueur. La pression transvalvulaire hydrostatique a été utilisée pour contrôler l’hétérogénéité temporelle en fixant chimiquement la conformation de la valve cardiaque. La micro-tomodensitométrie (μCT) a été utilisée pour confirmer la géométrie de la valve cardiaque et fournir une référence pour le traitement des échantillons en aval nécessaire à la microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM). Des images SEM en série haute résolution de la matrice extracellulaire (ECM) ont été prises et reconstruites pour fournir une représentation 3D locale de son organisation. Les méthodes d’imagerie μCT et SBF-SEM ont ensuite été corrélées pour surmonter la variation spatiale à travers la valve pulmonaire. Bien que les travaux présentés soient exclusivement sur la valve pulmonaire, cette méthodologie pourrait être adoptée pour décrire l’organisation hiérarchique dans les systèmes biologiques et est essentielle pour la caractérisation structurelle sur plusieurs échelles de longueur.

Introduction

La valve pulmonaire (PV) sert à assurer le flux sanguin unidirectionnel entre le ventricule droit et l’artère pulmonaire. Les malformations valvulaires pulmonaires sont associées à plusieurs formes de cardiopathie congénitale. Le traitement actuel de la cardiopathie congénitale (HVD) est la réparation valvulaire ou le remplacement valvulaire, qui peut nécessiter de multiples chirurgies invasives tout au long de la vie d’un patient1. Il a été largement admis que la fonction de la valve cardiaque est dérivée de sa structure, souvent appelée corrélat structure-fonction. Plus précisément, les propriétés géométriques et biomécaniques du cœur dictent sa fonction. Les propriétés mécaniques, à leur tour, sont déterminées par la composition et l’organisation de l’ECM. En développant une méthode pour déterminer les propriétés biomécaniques des valves cardiaques murines, des modèles animaux transgéniques peuvent être utilisés pour interroger le rôle de l’ECM sur la fonction et le dysfonctionnement des valvescardiaques 2,3,4,5.

Le modèle animal murin a longtemps été considéré comme la norme pour les études moléculaires parce que les modèles transgéniques sont plus facilement disponibles chez la souris que chez d’autres espèces. Les modèles transgéniques murins fournissent une plate-forme polyvalente pour la recherche sur les maladies liées aux valves cardiaques6. Cependant, l’expertise chirurgicale et les exigences en matière d’instrumentation pour caractériser à la fois la géométrie et l’organisation ecm ont été un obstacle majeur à l’avancement de la recherche HVD. Les données hstologiques dans la littérature fournissent une image du contenu de la matrice extracellulaire de la valve cardiaque murine, mais uniquement sous la forme d’images 2D, et sont incapables de décrire son architecture 3D7,8. De plus, la valve cardiaque est à la fois spatialement et temporellement hétérogène, ce qui rend difficile de tirer des conclusions entre les expériences concernant l’organisation de l’ECM si l’échantillonnage et la conformation ne sont pas fixés. Les méthodes conventionnelles de caractérisation 3D, telles que l’IRM ou l’échocardiographie 3D, ne fournissent pas la résolution nécessaire pour résoudre les composants ECM9,10.

Ce travail détaille un flux de travail entièrement corrélatif où l’hétérogénéité temporelle due au cycle cardiaque a été abordée en fixant la conformation du PV murin avec la pression transvalvulaire hydrostatique. L’hétérogénéité spatiale a été contrôlée avec précision en échantillonnant les régions d’intérêt et en enregistrant des ensembles de données provenant de différentes modalités d’imagerie, en particulier la microscopie électronique à balayage μCT et à balayage de bloc série, sur différentes échelles de longueur. Cette méthode de repérage avec μCT pour guider l’échantillonnage en aval a été proposée précédemment, mais comme la valve pulmonaire présente une variation temporelle, un niveau de contrôle supplémentaire était nécessaire au niveau chirurgical11.

Les études in vivo décrivant la biomécanique des valves cardiaques murines sont rares et, au lieu de cela, s’appuient sur des modèles informatiques pour décrire le comportement de déformation. Il est d’une importance cruciale que les données extracellulaires locales sur l’échelle nanométrique soient liées à la géométrie et à l’emplacement de la valve cardiaque. Ceci, à son tour, fournit des distributions quantifiables et cartographiées spatialement des protéines ECM contribuant mécaniquement, qui peuvent être utilisées pour renforcer les modèles de valves cardiaques biomécaniques existants12,13,14.

Protocol

L’utilisation d’animaux dans cette étude était conforme au comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement du Nationwide Children’s Hospital en vertu du protocole AR13-00030. 1. Excision valvulaire pulmonaire Autoclavez les outils nécessaires à la dissection de la souris. Cela comprend les ciseaux fins, les micro-pinces, les pinces micro vasculaires, les pinces d’application de pince, les porte-micro-aiguilles, les ciseaux à ressort et les rétracteurs….

Representative Results

L’anastomose de l’artère pulmonaire au tube de pressurisation est illustrée à la figure 1A. Après l’application de la pression hydrostatique, le tronc pulmonaire se distend radialement(Figure 1B)indiquant que les feuillets de la valve pulmonaire sont dans une configuration fermée. La conformation valvulaire pulmonaire a été confirmée par μCT. Dans ce cas, les folioles étaient coapt (fermées) et l’anneau était circulaire (…

Discussion

L’enlèvement des ventricules sert à deux fins. Premièrement, exposer le côté ventricule à la pression atmosphérique, n’ayant donc besoin que d’appliquer une pression transvalvulaire du côté artériel de la valve pulmonaire pour se fermer, et deuxièmement, fournir une base stable pour empêcher la torsion du tronc pulmonaire. Pendant la pressurisation, le tronc pulmonaire se distendait radialement et inférieurement, ce qui le rend sujet à la torsion, provoquant l’effondrement du tronc pulmonaire. Le pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu, en partie, par les subventions R01HL139796 et R01HL128847 à CKB et RO1DE028297 et CBET1608058 pour DWM.

Materials

25% glutaraldehyde (aq) EMS 16210 Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
200 proof ethanol EMS 15055
22G needle BD 305156
3 mL syringe BD 309657
3-way stopcock Smiths Medical ASD, Inc. MX5311L
4% osmium tetroxide EMS 19150 Staining component
4% paraformaldehyde (aq) EMS 157-4-100 Primary fixative component
Absorbable hemostat Ethicon 1961
Acetone EMS 10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0 AROSurgical instruments Corporation TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0 AROSurgical instruments Corporation SN-1956
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664 Approximately 1 yo
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamp applying forcep FST 00072-14
Cotton tip applicators Fisher Scientific 23-400-118
DPBS Gibco 14190-144
Dumont #5 forcep FST 11251-20
Dumont #5/45 forceps FST 11251-35
Dumont #7 fine forcep FST 11274-20
Durcupan ACM resin EMS 14040 For embedding
Fine scissor FST 14028-10
Heliscan microCT Thermo Fisher Scientific Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
L-aspartic acid Sigma-Aldrich 56-84-8 Staining component
Lead nitrate EMS 17900 Staining component
low-vacuum backscatter detector Thermo Fisher Scientific VSDBS SEM backscatter detector
Micro-adson forcep FST 11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile EMD Millipore SLGP033NS
Non-woven songes McKesson Corp. 94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich 14459-95-1 Staining component
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3
Pressure monitor line Smiths Medical ASD, Inc. MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule EMS 69910-01 Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich 6131-99-3 Buffer
Solibri retractors FST 17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater Leica EM ACE600 Gold coater
Surgical microscope Leica M80
Thiocarbohydrazide (TCH) EMS 21900 Staining component
Tish needle holder/forcep Micrins MI1540
Trimmer Wahl 9854-500
Uranyl acetate EMS 22400 Staining component
Volumescope scanning electron microscope Thermo Fisher Scientific VOLUMESCOPESEM Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution Akorn Inc. NADA# 139-236

References

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Cite This Article
Liu, Y., Lee, Y., Yi, T., Wu, K., Bouchet-Marquis, C., Chan, H., Breuer, C. K., McComb, D. W. Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve. J. Vis. Exp. (174), e62581, doi:10.3791/62581 (2021).

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