Este protocolo fornece etapas detalhadas para uma tarefa de localização de objetos com quatro repetições usando a mesma coorte de ratos. Codificação fraca e forte pode produzir memórias de curto e longo prazo. A flexibilidade do protocolo com a repetição pode ser benéfica para estudos envolvendo operações cirúrgicas economizando tempo e trabalho.
O reconhecimento do local de objeto é um método proeminente usado para investigar a memória espacial em roedores. Esta memória de reconhecimento de local de objeto forma a base da tarefa de localização do objeto. Este artigo fornece um protocolo extensivo para orientar o estabelecimento de uma tarefa de localização de objetos com a opção de até quatro repetições usando a mesma coorte de ratos. Protocolos de codificação fracos e fortes podem ser usados para estudar memórias espaciais de curto e longo prazo de força variada e para permitir a implementação de manipulações relevantes inibidoras de memória ou -aprimoradas. Além disso, a repetição do teste com o contrabalanciamento aqui apresentado permite a combinação de resultados de dois ou mais testes para comparação interna para reduzir a variabilidade entre ratos. Este método ajuda a aumentar o poder estatístico e é fortemente recomendado, particularmente na execução de experimentos que produzem alta variação no comportamento individual. Isso refina diretamente o estudo aumentando os dados obtidos de cada animal e reduzindo o número total de animais necessários. Finalmente, a implementação da tarefa de localização de objetos repetidos aumenta a eficiência dos estudos que envolvem procedimentos cirúrgicos economizando tempo e trabalho.
Tarefas de reconhecimento espontâneo (por exemplo, reconhecimento de objetos, reconhecimento de objetos) têm sido utilizadas em grande medida na investigação da memória em roedores. Esses testes são diferentes da variedade de testes utilizados para avaliar a memória que se baseiam no condicionamento do medo ou na motivação da recompensa, na qual as tarefas de reconhecimento espontâneo são baseadas apenas no comportamento exploratório espontâneo em relação a novos estímulos. Esse comportamento, referido como “preferência neolética”1,é inerente a roedores, bem como em outras espécies de mamíferos e alguns não-mamíferos, como aves e peixes2. O reconhecimento do local do objeto, que depende da memória espacial, pode ser observado usando a tarefa de localização do objeto (também conhecida como tarefa de reconhecimento de objetos espaciais)3. Estudos de lesão mostraram que o reconhecimento do local do objeto requer um hipocampo intacto4,5. Devido ao protocolo de treinamento relativamente simples e à ausência de qualquer reforço, essa tarefa é preferível em muitos estudos. A ausência de reforço positivo e negativo minimiza os parâmetros adicionais e regiões cerebrais que podem impulsionar o comportamento. Assim, o comportamento aqui é neutro e é baseado na curiosidade e na memória espacial, permitindo a investigação de mecanismos que estão envolvidos na codificação, consolidação e recuperação da memória espacial.
O protocolo para a tarefa de localização de objetos normalmente consiste em sessões de habitação seguidas de uma única sessão de testes de codificação e teste, separadas por um período de atraso, que varia de vários minutos para horas. Recomenda-se fortemente que os ratos sejam tratados de antemão para minimizar o nível de estresse dos animais e, portanto, comportamentos que possam afetar a memória de reconhecimento, como a aversão à novidade. Da mesma forma, um protocolo de habitação bem desenhado desempenha um papel essencial na prevenção do estresse que pode dificultar o comportamento natural do rato durante a tarefa. No entanto, a extensão do manuseio e da habitação varia em grande parte entre laboratórios e experimentadores, o que pode contribuir para a baixa replicabilidade6,7,8. No teste de codificação, o rato tem tempo para explorar uma arena com dois objetos idênticos localizados em dois cantos designados. No teste, que é adiado por um período, o rato tem tempo para explorar a arena com o mesmo par de objetos, mas desta vez um deles foi movido para um novo local. A preferência espontânea exibida pelos ratos e o consequente aumento do tempo gasto explorando o objeto no novo local são indicativos de reconhecimento espacial e da memória dos locais do objeto3. A modificação do ensaio de codificação (duração e número de repetições) influencia a força da memória.
Dependendo do objetivo do estudo, o comprimento do atraso entre a codificação e os ensaios de teste pode ser modificado para modelar memória de curto prazo independente da proteína ou memória de longo prazo dependente de proteínas. Assim, a tarefa de localização do objeto pode ser usada para uma ampla variedade de estudos, adaptando o protocolo conforme necessário. Além disso, também são possíveis a implementação de manipulações experimentais, como intervenções farmacológicas e optogenéticas entre esses ensaios, assim como a imagem in vivo. Existem vários estudos9,10 que relatam iterações repetidas da tarefa de localização do objeto dentro da mesma coorte de ratos. Isso contrasta com o uso tradicional em que um animal tem uma sessão sem repetições. No entanto, a eficácia desses paradigmas não foi investigada minuciosamente, nem há nenhum documento de método que os descreva. Até onde sabemos, esta é a primeira descrição relatada de um protocolo que descreve em detalhes uma tarefa de localização de objeto com até quatro repetições usando a mesma coorte de ratos, que também compara sistematicamente os resultados de cada repetição. As repetições podem ser usadas para contrabalançar as condições experimentais para permitir a comparação entre sujeitos com a variabilidade reduzida entre os testes. A repetição confiável da tarefa permite que os dados sejam agrupados, o que significa que uma quantidade suficientemente grande de dados pode ser gerada usando um número relativamente pequeno de ratos. Finalmente, as repetições usando o mesmo rato podem ser benéficas em experimentos envolvendo operações cirúrgicas e implantações, diminuindo o número de ratos necessários que, consequentemente, economizam tempo e custos de mão-de-obra.
Este estudo apresenta um protocolo extenso detalhando como executar uma tarefa de localização de objetos em ratos adultos usando testes de codificação fortes e fracos seguidos de testes de teste com atrasos de 1h e 24 horas. O forte protocolo de codificação produz memória de reconhecimento estatisticamente significativa quando testada com atrasos de 1h e 24h e, portanto, pode ser usada para estudar memórias de curto e longo prazo após a implementação de manipulações para inibir essas memórias11. Em contraste, o protocolo de codificação fraco só produz memória significativa de curto prazo quando testado com um atraso de 1h. A ausência de memória de longo prazo pode ser usada para estudar manipulações para melhorar a retenção da memória11,12. Este protocolo também inclui sessões detalhadas de manuseio e habitação, que visam aumentar a replicabilidade da tarefa de localização do objeto. Este artigo também demonstra a repetição da tarefa em quatro contextos distintos com a mesma coorte de ratos usando o fraco protocolo de codificação, que é confirmado para produzir resultados replicáveis e consistentes a cada vez.
A tarefa de localização do objeto pode ser usada em uma variedade de estudos para investigar a memória espacial, como descrito anteriormente. A flexibilidade da configuração permite a modelagem da memória de curto e longo prazo de diferentes pontos fortes, e pode ser facilmente implementada a um baixo custo. No entanto, como há muitos parâmetros no protocolo que podem influenciar os resultados, e diferentes estudos variam ligeiramente nesses parâmetros6,pode-se enfrentar dificuldades para implementar a tarefa com sucesso pela primeira vez. O protocolo acima destina-se a orientar os leitores através deste processo sem problemas. Outras etapas cruciais que podem ser significativas na implementação bem sucedida da tarefa com alta replicabilidade serão discutidas abaixo.
Embora a sessão de codificação/teste muitas vezes seja o foco ao executar experimentos de localização de objetos, os protocolos de manuseio e habitação têm um efeito profundo no resultado deste tipo de testes comportamentais onde o resultado depende do comportamento natural de ratosnão perturbados 14,15. Como tal, as etapas anteriores à sessão de codificação/teste devem ser projetadas com cautela, pois podem influenciar o comportamento e a memória dos ratos e, consequentemente, influenciar os resultados finais. Um bom nível de manuseio e habitação de tal forma que os ratos se familiarizem com o experimentador e a tarefa minimizará o efeito dos fatores de estresse, aumentando a probabilidade de exibir comportamento natural8. Como mencionado no protocolo, o manuseio pode começar tão cedo quanto o desmasar de filhotes se a cepa de rato for mantida na instalação doméstica. Com base na experiência prévia (dados não apresentados) e a partir de vários estudos anteriores16,17, esse manejo precoce resulta em baixa ansiedade e maior curiosidade nos meses seguintes.
Como a tarefa de localização do objeto depende apenas do impulso exploratório intrínseco dos ratos, o comportamento esperado pode ser facilmente dificultado se os ratos não estiverem ansiosos para explorar ou relutantes em abordar a novidade, que é chamada de “comportamento neofóbico”1. Como tal, é altamente recomendável incluir um protocolo de manuseio e habitação completo de acordo com as necessidades específicas do estudo. Este protocolo pode ser usado como um guia de exigência mínima, e outras etapas podem ser implementadas (por exemplo,se o estudo for incluir injeções em um estágio posterior, é necessária a habituação a procedimentos de injeção e posição de retenção específica. A tensão e a idade dos ratos experimentais são dois outros fatores influentes e devem ser considerados antes de planejar um experimento para evitar resultados subótimos. Diferentes cepas de ratos podem ter diferentes comportamentos e níveis de ansiedade de linha de base18,19,20 e, portanto, ajustes específicos ao protocolo podem ser necessários dependendo da tensão utilizada.
Este protocolo é confirmado para funcionar bem com ratos transgênicos Th-Cre com a tensão Long-Evans cruzada quatro vezes para Lister Hooded tensão e ratos de lister encapuzados. Uma idade inicial logicamente ideal para ratos em experimentos comportamentais é de cerca de 12 semanas20,mas a variabilidade entre tensões e os requisitos específicos da tarefa devem ser contabilizados. Também pode ser possível usar ratos em desenvolvimento se for de interesse para o estudo, embora ajustes no protocolo possam ser necessários e não estejam cobertos aqui. No entanto, é importante considerar se o rato em uma determinada idade desenvolveu as funções cognitivas necessárias para executar essa tarefa com sucesso. Um estudo21 que investiga isso relatou que apenas os ratos adolescentes no pós-natal 38 e não antes, mostraram memória espacial aocêntrica refletida na preferência pelo objeto no local do romance, como observado em ratos adultos. O protocolo aqui apresentado foi bem sucedido usando ratos que tinham de 15 a 16 semanas no início da primeira sessão de codificação/teste. Anteriormente, o mesmo protocolo de codificação forte produzia resultados subótimos para negativos ao usar ratos de 23 semanas de idade que não tinham atingido o nível ideal de habituação devido à falta de manuseio e habituação em uma idade jovem o suficiente. Esses ratos não conseguiram ter um desempenho diferente do nível do acaso ou, de fato, exibiram aversão à novidade como observado em termos de preferência pelos objetos estáveis em vez dos objetos deslocados (dados não mostrados). Esses resultados evidenciam que a idade e o tempo de utilização do manuseio podem ter impacto na eficácia da habituação e, consequentemente, contribuir para a observação do comportamento ansioso e neofóbico nos testes.
Aqui, dois protocolos diferentes são delineados, garantindo codificação forte ou fraca na tarefa de localização do objeto. Durante o estabelecimento desses protocolos, observou-se que o interesse pelos objetos diminuiu após 5-10 minutos de exploração durante ensaios longos únicos(por exemplo, codificação de 20 min), e os ratos eventualmente pararam de explorar. Isso resulta em memória mais fraca dos locais do objeto. Um protocolo de codificação que intercala ensaios de codificação com curtos períodos de descanso (por exemplo, codificação de 3 x 5 minutos) supera isso e leva a uma alta exploração ao longo dos ensaios. Assim, o tempo de exploração ativo e o layout diferente desses dois protocolos de codificação influenciam a força da memória, que é mais forte após codificação de 3 x 5 min do que após protocolos de codificação de 20 min. Resultados semelhantes também podem ser alcançados usando durações ligeiramente diferentes com protocolos de ensaio único versus intercalados, e ajustes podem ser feitos para atender às necessidades do estudo e da cepa de ratos.
Ao contrário dos protocolos usando um campo aberto branco simples com apenas pistas externas na sala, o protocolo aqui apresentado usa uma arena com contextos distintos e pistas intra-maze que provavelmente requer mais tempo para aprender. Assim, recomenda-se a adição de uma etapa de habitação de contexto no protocolo anterior ao teste de codificação. Isso permitirá que os ratos formem um mapa espacial de cada contexto durante a habituação e diminuam a duração do seguinte ensaio de codificação, pois os ratos só precisarão codificar os locais dos objetos em relação a este mapa. Além disso, a habituação de contexto permitirá que os ratos se habituam a qualquer possível distrator dentro de cada contexto, como as pistas espaciais 3D, minimizando comportamentos que não sejam a exploração de objetos na sessão de codificação/teste a seguir. Com a implementação de um método de contrabalanceamento completo que consiste em vários níveis (ou seja, uma ampla gama de combinações de localização de objeto (contadores) e direção do deslocamento do objeto), preferências indesejadas que podem aumentar devido a variações na intensidade da luz e cores/padrões de parede nos cantos da arena são minimizadas.
Vários fatores devem ser considerados ao repetir a tarefa de aumentar a replicabilidade entre sessões de codificação/teste e minimizar a influência da repetição. Em primeiro lugar, contextos distintos (tanto quanto o número de repetições de sessões de codificação/teste) precisam ser projetados para evitar o acúmulo de memória espacial que pode ser causado pela realização das sessões repetidas usando o mesmo contexto. Para isso, utilizou-se um aparelho com paredes substituíveis de diferentes cores e padrões(Figura 1B,C). As paredes distintas e objetos 3D (como brinquedos ou pequenos itens cotidianos de cores e formas distintas, ver protocolo e Figura 1C) pendurados nas paredes são os sinais espaciais e pontos turísticos que os ratos potencialmente usam para aprender locais de objetos em relação aos seus contextos. No caso de um teste não produzir preferência pelo objeto movido, pode-se considerar a alteração desses parâmetros do contexto (design de parede e pistas espaciais). Alternativamente, uma arena retangular ou em forma circular pode ser usada para tarefas de localização de objetos em vez de uma arena quadrada como neste protocolo. Arenas circulares são relatadas para eliminar preferências de canto22 que é frequentemente observada em arenas com cantos e, portanto, pode ser benéfico ao lidar com uma tensão particularmente alta de ratos ou ratos. Enquanto os requisitos de criação de quatro contextos distintos neste protocolo funcionam de forma ideal com uma forma quadrangular, uma arena circular também pode ser funcional após alguns ajustes.
Em segundo lugar, os intervalos entre cada sessão de codificação/teste devem ser determinados de modo que os ratos mantenham o mesmo nível de interesse cada vez, evitando o risco de aprendizado cumulativo resultante de um cronograma denso de repetições. Normalmente, um intervalo de pelo menos o dobro do tempo de atraso entre os ensaios de codificação e teste é suficiente, com intervalos mais longos sendo mais favoráveis para mais de duas repetições. Isso significa que, enquanto um intervalo mínimo de 48h após um teste de 24 horas é suficiente para uma ou duas repetições, o uso de um intervalo de 1 semana é recomendado para quatro repetições. Como os resultados na Figura 5 e a comparação usando a ANOVA mostram, a tarefa pode ser repetida com sucesso quatro vezes. Com base nisso, o protocolo estabelecido pode ser usado para contrabalançar até quatro condições experimentais. O número de grupos experimentais determina o número de repetições de sessões de codificação/ensaio em contextos distintos. Os resultados na Figura 5 representam uma forma possível de utilizar o protocolo com dois grupos experimentais. Os grupos foram contrabalançados em duas sessões, e as mesmas condições foram repetidas em duas sessões adicionais (para fins de validação). O segundo conjunto de sessões contrabalanceada também poderia ser usado para contrabalançar novas condições. Da mesma forma, três ou quatro condições experimentais podem ser comparadas usando três ou quatro sessões contrabalanceadas, respectivamente.
Nesses casos, os contextos devem ser projetados para acomodar características contrastantes descritas no protocolo. Vale ressaltar que o design contrabalanceado pode não ser adequado para experimentos nos quais manipulações adicionais, como uma intervenção farmacológica que possa deixar um efeito ou dano duradouro, devem ser usadas. Para manter a eficácia e a replicabilidade dos testes, o experimento deve ser projetado em conformidade. Os dados dos ensaios repetidos podem ser apresentados e analisados de várias formas, conforme demonstrado na Figura 5. Para uma análise inicial, os grupos experimentais em cada contexto podem ser individualmente comparados ao nível de acaso usando um teste tde uma amostra para determinar qualquer preferência significativa(Figura 5B,D). Isso pode ser útil para obter uma rápida compreensão dos dados, mas garante apenas uma comparação indireta dos grupos. Assim, para comparar dois ou mais grupos, os dados devem ser analisados usando testes tde duas amostras (emparelhados ou não) ou ANOVA, respectivamente. Isso pode ser na forma de comparação entre os sujeitos dos grupos dentro de uma única sessão de codificação/teste (Figura 4A e Figura 5B,D) ou comparação dentro do assunto dos grupos de dois (ou mais) contextos contrabalanceados(Figura 5C,E). Este último método é fortemente recomendado, especialmente quando se trata de condições de memória fracas, o que, como explicado anteriormente, resulta em alta variância devido à aleatoriedade no comportamento.
A combinação dos contextos contrabalanceados leva a grupos maiores que são necessários para visualizar de forma confiável o comportamento do grupo com variação mínima. Usando um protocolo com repetições em sessões contrabalanceadas, pode-se esperar uma diminuição no número de ratos para cerca de um terço do número que seria necessário usando um único teste com o mesmo poder estatístico. Normalmente, tamanhos amostrais em uma faixa de 7 a 15 ratos (total) para sessões contrabalanceada e em uma faixa de 20 a 50 ratos (10 a 25 por grupo) para uma única sessão com tamanho de efeito e potência ambos maiores que 0,8 são suficientes. A diminuição do número de animais necessários e o aumento das informações obtidas de cada animal utilizando esse protocolo refinam o estudo e servem aos princípios 3R dos usos éticos dos animais em pesquisa. É importante nesta etapa ter em mente que o comportamento aleatório do rato, que não é acompanhado com uma memória forte, pode resultar em preferências individuais fortes tanto abaixo quanto acima do acaso, mas a média do grupo deve render uma preferência não significativamente diferente do acaso. Os dados individuais devem ser interpretados cuidadosamente. A distribuição de pontos de dados individuais dentro de um grupo também pode ser informativa para a interpretação dos resultados. Como visto na Figura 4 e Figura 5,a distribuição muda dependendo da força da memória. No geral, o protocolo aqui apresentado pode ser seguido facilmente para implementar a tarefa de localização do objeto com repetições para modelar memória espacial de curto e/ou longo prazo. O protocolo de treinamento simples e flexível e a possibilidade de implementar novas manipulações tornam essa tarefa uma escolha popular. Essas modificações no protocolo permitem a investigação de etapas específicas, como aquisição de memória, consolidação e recall.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara e David Bett por comentários e sugestões perspicazes. Este estudo foi apoiado por Erasmus+ (para G.B. e L.N.); a Escola de Pós-Graduação em Saúde da Universidade de Aarhus (para K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) e PROMEMO – Center for Proteins in Memory, um Centro de Excelência financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa Dinamarquesa (DNRF133) (para T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |