Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor een objectlocatietaak met vier herhalingen met hetzelfde cohort ratten. Zwakke en sterke codering kan korte- en langetermijnherinneringen produceren. De flexibiliteit van het protocol met herhaling kan gunstig zijn voor studies met chirurgische ingrepen door tijd en arbeid te besparen.
Objectplaatsherkenning is een prominente methode die wordt gebruikt om ruimtelijk geheugen bij knaagdieren te onderzoeken. Dit objectplaatsherkenningsgeheugen vormt de basis van de objectlocatietaak. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol om de vaststelling van een objectlocatietaak te begeleiden met de mogelijkheid van maximaal vier herhalingen met hetzelfde cohort ratten. Zowel zwakke als sterke coderingsprotocollen kunnen worden gebruikt om ruimtelijke herinneringen op korte en lange termijn van verschillende sterkte te bestuderen en om de implementatie van relevante geheugenremmende of -verbeterende manipulaties mogelijk te maken. Bovendien maakt herhaling van de test met de hier gepresenteerde tegenwicht de combinatie van resultaten van twee of meer tests voor vergelijking binnen het onderwerp mogelijk om de variabiliteit tussen ratten te verminderen. Deze methode helpt de statistische kracht te vergroten en wordt sterk aanbevolen, vooral bij het uitvoeren van experimenten die een hoge variatie in individueel gedrag veroorzaken. Dit verfijnt de studie direct door de verkregen gegevens van elk dier te vergroten en het totale aantal benodigde dieren te verminderen. Ten slotte verhoogt de implementatie van de herhaalde objectlocatietaak de efficiëntie van studies die chirurgische procedures omvatten door tijd en arbeid te besparen.
Spontane herkenningstaken(bijv. Objectherkenning, objectplaatsherkenning) zijn in grote mate gebruikt bij het onderzoek naar het geheugen bij knaagdieren. Deze tests zijn anders dan de verscheidenheid aan tests die worden gebruikt voor het beoordelen van het geheugen en die zijn gebaseerd op angstconditionering of beloningsmotivatie, in die richting van spontane herkenningstaken zijn uitsluitend gebaseerd op spontaan verkennend gedrag naar nieuwe stimuli. Dit gedrag, aangeduid als ‘neotische voorkeur’1, is inherent aan knaagdieren en aan andere zoogdiersoorten en sommige niet-zoogdieren zoals vogels en vissen2. Objectplaatsherkenning, die afhankelijk is van het ruimtelijk geheugen, kan worden waargenomen met behulp van de objectlocatietaak (ook bekend als ruimtelijke objectherkenningstaak)3. Laesiestudies hebben aangetoond dat objectplaatsherkenning een intacte hippocampusvereist 4,5. Vanwege het relatief eenvoudige trainingsprotocol en de afwezigheid van enige versterking, heeft deze taak in veel onderzoeken de voorkeur. De afwezigheid van zowel positieve als negatieve versterking minimaliseert de extra parameters en hersengebieden die het gedrag kunnen aansturen. Daarom is gedrag hier neutraal en is het gebaseerd op nieuwsgierigheid en ruimtelijk geheugen, waardoor het onderzoek mogelijk is naar mechanismen die betrokken zijn bij het coderen, consolideren en ophalen van het ruimtelijke geheugen.
Het protocol voor objectlocatietaken bestaat meestal uit gewenningssessies gevolgd door een enkele sessie van coderings- en testproeven, gescheiden door een vertragingsperiode, die varieert van enkele minuten tot uren. Het wordt sterk aanbevolen dat ratten van tevoren worden behandeld om het stressniveau van de dieren te minimaliseren, en dus gedrag dat het herkenningsgeheugen kan beïnvloeden, zoals afkeer van nieuwigheid. Evenzo speelt een goed ontworpen gewenningsprotocol een essentiële rol bij het voorkomen van stress die het natuurlijke gedrag van de rat tijdens de taak kan belemmeren. De mate van hantering en gewenning varieert echter grotendeels tussen laboratoria en experimentatoren, wat kan bijdragen aan een lage repliceerbaarheid6,7,8. In de coderingsproef krijgt de rat de tijd om een arena te verkennen met twee identieke objecten in twee aangewezen hoeken. In de testproef, die een periode wordt uitgesteld, krijgt de rat de tijd om de arena met hetzelfde paar objecten te verkennen, maar deze keer is een van hen verplaatst naar een nieuwe locatie. De spontane voorkeur van de ratten en de daaruit voortvloeiende toename van de tijd die wordt besteed aan het verkennen van het object op de nieuwe locatie zijn indicatief voor ruimtelijke herkenning en het geheugen van de objectlocaties3. Wijziging van de coderingsproef (duur en aantal herhalingen) beïnvloedt de sterkte van het geheugen.
Afhankelijk van het doel van de studie kan de lengte van de vertraging tussen codering en testproeven worden gewijzigd om eiwitsynthese-onafhankelijk kortetermijngeheugen of eiwitsynthese-afhankelijk langetermijngeheugen te modelleren. Daarom kan de objectlocatietaak worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoeken door het protocol indien nodig aan te passen. Verder zijn implementatie van experimentele manipulaties, zoals farmacologische en optogenetische interventies, ook mogelijk tussen deze studies, net als in vivo beeldvorming. Er zijn verschillende studies9,10 die herhaalde iteraties van de objectlocatietaak binnen hetzelfde rattencohort rapporteren. Dit staat in contrast met het traditionele gebruik waarbij een dier één sessie heeft zonder herhalingen. De effectiviteit van deze paradigma’s is echter niet grondig onderzocht, noch zijn er method papers die deze beschrijven. Voor zover bekend is dit de eerste gerapporteerde beschrijving van een protocol dat in detail een objectlocatietaak beschrijft met maximaal vier herhalingen met behulp van hetzelfde rattencohort, dat ook systematisch de resultaten van elke herhaling vergelijkt. Herhalingen kunnen worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan experimentele omstandigheden om vergelijking binnen het onderwerp mogelijk te maken met verminderde variabiliteit tussen tests. De betrouwbare herhaling van de taak maakt het mogelijk om gegevens te bundelen, wat betekent dat voldoende grote hoeveelheden gegevens kunnen worden gegenereerd met behulp van een relatief klein aantal ratten. Ten slotte kunnen herhalingen met dezelfde rat nuttig zijn bij experimenten met chirurgische ingrepen en implantaties door het aantal vereiste ratten te verlagen, wat bijgevolg tijd en arbeidskosten bespaart.
Deze studie presenteert een uitgebreid protocol waarin wordt beschreven hoe een objectlocatietaak bij volwassen ratten kan worden uitgevoerd met behulp van sterke en zwakke coderingsproeven gevolgd door testproeven met vertragingen van 1 uur en 24 uur. Het sterke coderingsprotocol produceert statistisch significant herkenningsgeheugen wanneer het wordt getest met 1-uurs en 24-uurs vertragingen en kan dus worden gebruikt om zowel kortetermijn- als langetermijngeheugens te bestuderen bij implementatie van manipulaties om deze herinneringen te remmen11. Het zwakke coderingsprotocol produceert daarentegen alleen een significant kortetermijngeheugen wanneer het wordt getest met een vertraging van 1 uur. De afwezigheid van langetermijngeheugen kan worden gebruikt om manipulaties te bestuderen voor het verbeteren van het behoud van geheugen11,12. Dit protocol omvat ook gedetailleerde verwerkings- en gewenningssessies, die gericht zijn op het vergroten van de repliceerbaarheid van de objectlocatietaak. Dit artikel toont ook herhaling van de taak in vier verschillende contexten met hetzelfde cohort ratten met behulp van het zwakke coderingsprotocol, waarvan wordt bevestigd dat het elke keer reproduceerbare en consistente resultaten oplevert.
De objectlocatietaak kan in verschillende onderzoeken worden gebruikt om het ruimtelijk geheugen te onderzoeken zoals eerder beschreven. De flexibiliteit van de opstelling maakt het modelleren van korte- en langetermijngeheugen van verschillende sterktes mogelijk en kan eenvoudig tegen lage kosten worden geïmplementeerd. Omdat er echter veel parameters in het protocol zijn die de resultaten kunnen beïnvloeden, en verschillende studies enigszins variëren in deze parameters6, kan men problemen ondervinden bij het voor de eerste keer succesvol implementeren van de taak. Het bovenstaande protocol is bedoeld om lezers soepel door dit proces te leiden. Verdere cruciale stappen die van belang kunnen zijn voor de succesvolle implementatie van de taak met hoge repliceerbaarheid zullen hieronder worden besproken.
Hoewel de coderings- / testsessie vaak de focus is bij het uitvoeren van objectlocatie-experimenten, hebben hanterings- en gewenningsprotocollen een diepgaand effect op de uitkomst van dit soort gedragstests waarbij de uitkomst afhangt van ongestoord natuurlijk rattengedrag14,15. Als zodanig moeten de stappen voorafgaand aan de coderings- / testsessie met voorzichtigheid worden ontworpen, omdat ze het gedrag en het geheugen van ratten kunnen beïnvloeden en bijgevolg de eindresultaten kunnen beïnvloeden. Een goed niveau van hantering en gewenning, zodat ratten vertrouwd raken met de experimentator en de taak het effect van stressfactoren zal minimaliseren en tegelijkertijd de kans op het vertonen van natuurlijk gedrag zal vergroten8. Zoals vermeld in het protocol, kan de behandeling al beginnen bij het spenen van pups als de rattenstam in de thuisfaciliteit wordt gehandhaafd. Op basis van eerdere ervaringen (gegevens niet getoond) en van die van verschillende eerdere studies16,17, resulteert deze vroege behandeling in lage angst en verhoogde nieuwsgierigheid in de maanden die volgen.
Omdat de objectlocatietaak uitsluitend afhangt van de intrinsieke verkennende drive van de ratten, kan verwacht gedrag gemakkelijk worden belemmerd als ratten niet staan te popelen om te verkennen of terughoudend zijn om nieuwigheid te benaderen, wat wordt aangeduid als ‘neofoob gedrag’1. Als zodanig wordt het ten zeerste aanbevolen om een grondig behandelings- en gewenningsprotocol op te nemen volgens de specifieke behoeften van het onderzoek. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor minimale vereisten en verdere stappen kunnen worden geïmplementeerd(bijvoorbeeldals het onderzoek injecties in een later stadium moet omvatten, zijn gewenning aan injectieprocedures en specifieke houdpositie vereist). De stam en de leeftijd van de experimentele ratten zijn twee andere invloedrijke factoren en moeten worden overwogen voordat een experiment wordt gepland om suboptimale resultaten te voorkomen. Verschillende rattenstammen kunnen verschillende gedragingen en baseline angstniveaus18,19,20 hebben en daarom kan specifieke aanpassing van het protocol nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte stam.
Dit protocol is bevestigd dat het goed werkt met Th-Cre transgene ratten met Long-Evans stam vier keer teruggekruist naar Lister Hooded stam en wild-type Lister Hooded ratten. Een logisch ideale startleeftijd voor ratten in gedragsexperimenten is ongeveer 12 weken20, maar inter-strain variabiliteit en de specifieke vereisten van de taak moeten worden verantwoord. Het zou ook mogelijk kunnen zijn om ontwikkelende ratten te gebruiken als dit van belang is voor het onderzoek, hoewel aanpassingen aan het protocol nodig kunnen zijn en hier niet worden behandeld. Het is echter belangrijk om te overwegen of de rat op een bepaalde leeftijd de cognitieve functies heeft ontwikkeld die nodig zijn om deze taak met succes uit te voeren. Een studie21 die dit onderzocht, heeft gemeld dat alleen de adolescente ratten op postnatale dag 38 en niet eerder allocentrisch ruimtelijk geheugen vertoonden dat werd weerspiegeld in de voorkeur voor object op de nieuwe locatie, zoals waargenomen bij volwassen ratten. Het hier gepresenteerde protocol was succesvol met ratten die 15-16 weken oud waren aan het begin van de eerste coderings- / testsessie. Voorheen produceerde hetzelfde sterke coderingsprotocol suboptimale tot negatieve resultaten bij het gebruik van 23 weken oude ratten die niet het optimale niveau van gewenning hadden bereikt vanwege een gebrek aan behandeling en gewenning op een jong genoeg leeftijd. Deze ratten presteerden ofwel niet anders dan het toevalsniveau of vertoonden in feite een afkeer van nieuwheid zoals waargenomen in termen van voorkeur voor de stabiele objecten in plaats van de verplaatste objecten (gegevens niet getoond). Deze resultaten leveren bewijs dat de leeftijd en de timing van de gewenning van de omgang van invloed kunnen zijn op de effectiviteit van gewenning en als gevolg daarvan kunnen bijdragen aan de observatie van angstig en neofoob gedrag in de tests.
Hier worden twee verschillende protocollen beschreven, die zorgen voor sterke of zwakke codering in de objectlocatietaak. Tijdens het opstellen van deze protocollen werd waargenomen dat de interesse in de objecten afnam na 5-10 minuten verkenning tijdens enkele lange proeven(bijv. 20 minuten codering), en ratten stopten uiteindelijk met verkennen. Dit resulteert in een zwakker geheugen van de objectlocaties. Een coderingsprotocol dat coderingsproeven met korte rustperioden(bijv. 3 x 5 min codering) met elkaar verweeft, overwint dit en leidt tot een hoge verkenning tijdens de proeven. De actieve verkenningstijd en de verschillende lay-out van deze twee coderingsprotocollen beïnvloeden dus de sterkte van het geheugen, dat sterker is na 3 x 5 minuten codering dan na coderingsprotocollen van 20 minuten. Vergelijkbare resultaten kunnen ook worden bereikt met behulp van enigszins verschillende duur met protocollen voor één studie versus interleaved trial, en aanpassingen kunnen worden aangebracht om aan de behoeften van het onderzoek en de rattenstam te voldoen.
In tegenstelling tot protocollen die een gewoon wit open veld gebruiken met alleen externe signalen in de kamer, gebruikt het hier gepresenteerde protocol een arena met verschillende contexten en intra-doolhofsignalen die waarschijnlijk meer tijd nodig hebben om te leren. Daarom wordt de toevoeging van een contextgewenningsstap in het protocol voorafgaand aan de coderingsproef aanbevolen. Hierdoor kunnen ratten tijdens de gewenning een ruimtelijke kaart van elke context vormen en de duur van de volgende coderingsproef verkorten, omdat de ratten alleen de locaties van de objecten ten opzichte van deze kaart hoeven te coderen. Bovendien zal contextgewenning ratten in staat stellen om te wennen aan elke mogelijke afleider binnen elke context, zoals de 3D ruimtelijke signalen, waardoor ander gedrag dan objectverkenning in de coderings- / testsessie die moet volgen, wordt geminimaliseerd. Met de implementatie van een grondige tegenwichtsmethode bestaande uit verschillende niveaus(d.w.z. een breed scala aan objectlocatiecombinaties (tellers) en richting van de objectverplaatsing), worden ongewenste voorkeuren die kunnen stijgen als gevolg van variaties in lichtintensiteit en muurkleuren / patronen op de hoeken van de arena geminimaliseerd.
Bij het herhalen van de taak moet rekening worden gehouden met verschillende factoren om de repliceerbaarheid tussen coderings- / testsessies te vergroten en de invloed van herhaling te minimaliseren. Ten eerste moeten verschillende contexten (evenveel als het aantal herhalingen van coderings- / testsessies) worden ontworpen om de accumulatie van ruimtelijk geheugen te voorkomen die kan worden veroorzaakt door het uitvoeren van de herhaalde sessies met dezelfde context. Om dit te bereiken, werd een apparaat met vervangbare wanden van verschillende kleuren en patronen gebruikt(figuur 1B,C). De verschillende muren en 3D-objecten (zoals speelgoed of kleine alledaagse voorwerpen van verschillende kleuren en vormen, zie protocol en figuur 1C) die aan de muren hangen, zijn de ruimtelijke aanwijzingen en oriëntatiepunten die de ratten mogelijk gebruiken om objectlocaties te leren in relatie tot hun context. In het geval dat een test geen voorkeur voor het verplaatste object oplevert, kan het wijzigen van deze parameters van de context (muurontwerp en ruimtelijke aanwijzingen) worden overwogen. Als alternatief kan een rechthoekige of cirkelvormige arena worden gebruikt voor objectlocatietaken in plaats van een vierkante arena zoals in dit protocol. Van cirkelvormige arena’s wordt gemeld dat ze hoekvoorkeuren22 elimineren die vaak worden waargenomen in arena’s met hoeken, en daarom kan het nuttig zijn bij het omgaan met een bijzonder angstige ratten- of muizenbelasting. Hoewel de vereisten voor het creëren van vier verschillende contexten in dit protocol het meest optimaal werken met een vierhoekige vorm, kan een cirkelvormige arena ook functioneel worden gemaakt na enkele aanpassingen.
Ten tweede moeten de intervallen tussen elke coderings-/testsessie zodanig worden bepaald dat ratten elke keer hetzelfde interesseniveau behouden, terwijl het risico van cumulatief leren als gevolg van een dicht schema van herhalingen wordt vermeden. Meestal is een interval van ten minste het dubbele van de lengte van de vertragingstijd tussen codering en testproeven voldoende, waarbij langere intervallen gunstiger zijn voor meer dan twee herhalingen. Dit betekent dat, terwijl een interval van minimaal 48 uur na een 24-uurs test voldoende is voor één of twee herhalingen, het gebruik van een interval van 1 week wordt aanbevolen voor vier herhalingen. Zoals de resultaten in figuur 5 en de vergelijking met ANOVA laten zien, kan de taak vier keer met succes worden herhaald. Op basis hiervan kan het vastgestelde protocol worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan maximaal vier experimentele omstandigheden. Het aantal experimentele groepen bepaalt het aantal herhalingen van coderings-/proefsessies in verschillende contexten. De resultaten in figuur 5 vertegenwoordigen een mogelijke manier om het protocol met twee experimentele groepen te gebruiken. De groepen werden in twee sessies gecompenseerd en dezelfde omstandigheden werden herhaald in twee extra sessies (voor validatiedoeleinden). De tweede reeks sessies met tegenwicht zou ook kunnen worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan nieuwe omstandigheden. Evenzo kunnen drie of vier experimentele omstandigheden worden vergeleken met behulp van respectievelijk drie of vier sessies met contragewicht.
In deze gevallen moeten de contexten worden ontworpen om rekening te houden met contrasterende kenmerken die in het protocol worden beschreven. Het is opmerkelijk dat het ontwerp met contragewicht mogelijk niet geschikt is voor experimenten waarbij aanvullende manipulaties, zoals een farmacologische interventie die een langdurig effect of schade kan achterlaten, moeten worden gebruikt. Om de doeltreffendheid en repliceerbaarheid van de tests te behouden, moet het experiment dienovereenkomstig worden ontworpen. De gegevens van herhaalde tests kunnen op verschillende manieren worden gepresenteerd en geanalyseerd, zoals aangetoond in figuur 5. Voor een eerste analyse kunnen de experimentele groepen in elke context afzonderlijk worden vergeleken met het toevalsniveau met behulp van één-steekproef t-testom een significante voorkeur te bepalen (Figuur 5B, D). Dit kan nuttig zijn om snel inzicht te krijgen in de gegevens, maar het zorgt slechts voor een indirecte vergelijking van de groepen. Dus, voor het vergelijken van twee of meer groepen, moeten de gegevens worden geanalyseerd met behulp van twee-steekproef t-tests(gepaard of ongepaard) of ANOVA, respectievelijk. Dit kan zijn in de vorm van vergelijking tussen proefpersonen van de groepen binnen een enkele coderings-/testsessie(figuur 4A en figuur 5B,D)of vergelijking binnen het onderwerp van de groepen uit twee (of meer) tegenwichtcontexten(figuur 5C,E). De laatste methode wordt sterk aanbevolen, vooral bij het omgaan met zwakke geheugenomstandigheden, die, zoals eerder uitgelegd, resulteert in een hoge variantie als gevolg van willekeur in gedrag.
Het combineren van de contrabalanscontexten leidt tot grotere groepen die nodig zijn om het gedrag van de groep betrouwbaar te visualiseren met minimale variatie. Met behulp van een protocol met herhalingen in sessies met tegenwicht, kan men een afname van het aantal ratten verwachten tot ongeveer een derde van het aantal dat nodig zou zijn met behulp van een enkele test met dezelfde statistische kracht. Meestal zijn steekproefgroottes in een bereik van 7 tot 15 ratten (totaal) voor sessies met tegenwicht en in een bereik van 20 tot 50 ratten (10 tot 25 per groep) voor een enkele sessie met een effectgrootte en vermogen beide groter dan 0,8 voldoende. De afname van het aantal benodigde dieren en de toename van de informatie die we van elk dier verkrijgen met behulp van dit protocol, verfijnt zowel de studie als dient de 3R-principes van ethisch gebruik van dieren in onderzoek. Het is belangrijk om bij deze stap in gedachten te houden dat willekeurig rattengedrag, dat niet gepaard gaat met een sterk geheugen, kan resulteren in individuele sterke voorkeuren zowel onder als boven de kans, maar het groepsgemiddelde moet een voorkeur opleveren die niet significant verschilt van het toeval. Individuele gegevens moeten zorgvuldig worden geïnterpreteerd. De verdeling van individuele datapunten binnen een groep kan ook informatief zijn voor het interpreteren van resultaten. Zoals te zien is in figuur 4 en figuur 5,verandert de verdeling afhankelijk van de sterkte van het geheugen. Over het algemeen kan het hier gepresenteerde protocol eenvoudig worden gevolgd om de objectlocatietaak met herhalingen te implementeren om het ruimtelijk geheugen op korte en / of lange termijn te modelleren. Het eenvoudige en flexibele trainingsprotocol en de mogelijkheid om verdere manipulaties te implementeren, maken deze taak een populaire keuze. Deze wijzigingen in het protocol maken het mogelijk om bepaalde stappen te onderzoeken, zoals geheugenverwerving, consolidatie en recall.
The authors have nothing to disclose.
We willen Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara en David Bett bedanken voor inzichtelijke opmerkingen en suggesties. Deze studie werd ondersteund door Erasmus+ (tot G.B. en L.N.); de Graduate School of Health, Aarhus University (aan K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) en PROMEMO – Center for Proteins in Memory, een Center of Excellence gefinancierd door de Deense National Research Foundation (DNRF133) (aan T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |