Denne protokollen gir detaljerte trinn for en objektplasseringsoppgave med fire repetisjoner som bruker samme kohort av rotter. Svak og sterk koding kan gi kortsiktige og langsiktige minner. Fleksibiliteten i protokollen med repetisjon kan være gunstig for studier som involverer kirurgiske operasjoner ved å spare tid og arbeidskraft.
Objekt stedgjenkjenning er en fremtredende metode som brukes til å undersøke romlig minne hos gnagere. Dette gjenkjenningsminnet for objektstedet danner grunnlaget for objektplasseringsoppgaven. Dette dokumentet gir en omfattende protokoll for å veilede etableringen av en objektplasseringsoppgave med mulighet for opptil fire repetisjoner ved hjelp av samme kohort av rotter. Både svake og sterke kodingsprotokoller kan brukes til å studere kortsiktige og langsiktige romlige minner av varierende styrke og for å muliggjøre implementering av relevante minnehemmende eller -forsterkende manipulasjoner. I tillegg tillater gjentakelse av testen med motvekten som presenteres her kombinasjonen av resultater fra to eller flere tester for sammenligning innen emnet for å redusere variasjon mellom rotter. Denne metoden bidrar til å øke statistisk kraft og anbefales på det sterkeste, spesielt når du kjører eksperimenter som gir høy variasjon i individuell oppførsel. Dette forbedrer studien direkte ved å øke dataene som er hentet fra hvert dyr og redusere det totale antallet dyr som trengs. Til slutt øker implementeringen av den gjentatte objektplasseringsoppgaven effektiviteten til studier som involverer kirurgiske prosedyrer ved å spare tid og arbeidskraft.
Spontane anerkjennelsesoppgaver(f.eks. objektgjenkjenning, objektstedgjenkjenning) har i stor grad blitt brukt i undersøkelsen av minne hos gnagere. Disse testene er ulikt de forskjellige testene som brukes til å vurdere minne som er basert på enten fryktkondisjonering eller belønningsmotivasjon, ved at spontane anerkjennelsesoppgaver utelukkende er basert på spontan utforskende oppførsel mot nye stimuli. Denne oppførselen, referert til som ‘neotisk preferanse’1, er iboende hos gnagere så vel som i andre pattedyrarter og noen ikke-pattedyr som fugler og fisk2. Gjenkjenning av objektplassering, som avhenger av romlig minne, kan observeres ved hjelp av objektplasseringsoppgaven (også kjent som romlig objektgjenkjenningsoppgave)3. Lesjonsstudier har vist at objektplassgjenkjenning krever en intakt hippocampus4,5. På grunn av den relativt enkle opplæringsprotokollen og fraværet av forsterkning, er denne oppgaven å foretrekke i mange studier. Fraværet av både positiv og negativ forsterkning minimerer tilleggsparametrene og hjerneregionene som kan drive atferden. Derfor er oppførsel her nøytral og er basert på nysgjerrighet og romlig minne, slik at undersøkelse av mekanismer som er involvert i koding, konsolidering og gjenfinning av romlig minne.
Protokollen for objektplasseringsoppgaven består vanligvis av habituation-økter etterfulgt av en enkelt økt med kodings- og testforsøk, atskilt med en forsinkelsesperiode, som varierer fra flere minutter til timer. Det anbefales sterkt at rotter håndteres på forhånd for å minimere dyrets stressnivå, og dermed oppførsel som kan påvirke anerkjennelsesminnet, for eksempel aversjon mot nyhet. På samme måte spiller en godt designet habituation-protokoll en viktig rolle i å forhindre stress som kan hindre rottens naturlige oppførsel under oppgaven. Omfanget av håndtering og habituation varierer imidlertid i stor grad mellom laboratorier og eksperimenter, noe som kan bidra til lav replikerbarhet6,7,8. I kodingsforsøket får rotten tid til å utforske en arena med to identiske objekter plassert i to utpekte hjørner. I testforsøket, som er forsinket med en periode, får rotten tid til å utforske arenaen med samme par objekter, men denne gangen har en av dem blitt flyttet til et nytt sted. Den spontane preferansen utstilt av rotter og den resulterende økningen i tid brukt på å utforske objektet på den nye plasseringen, indikerer romlig anerkjennelse og minnet om objektplasseringene3. Endring av kodingsforsøket (varighet og antall repetisjoner) påvirker minnets styrke.
Avhengig av målet med studien, kan lengden på forsinkelsen mellom koding og testforsøk endres for å modellere proteinsynteseuavhengig korttidshukommelse eller proteinsynteseavhengig langtidshukommelse. Derfor kan objektplasseringsoppgaven brukes til et bredt spekter av studier ved å tilpasse protokollen etter behov. Videre er implementering av eksperimentelle manipulasjoner, som farmakologiske og optogenetiske intervensjoner, også mulig mellom disse studiene, som det er in vivo-avbildning. Det er flere studier9,10 som rapporterer gjentatte gjentakelser av objektplasseringsoppgaven i samme rottekohort. Dette står i kontrast til den tradisjonelle bruken der ett dyr har en økt uten repetisjoner. Imidlertid har effektiviteten av disse paradigmene ikke blitt grundig undersøkt, og det er heller ingen metodepapirer som beskriver disse. Så vidt vi vet, er dette den første rapporterte beskrivelsen av en protokoll som beskriver i detalj en objektplasseringsoppgave med opptil fire repetisjoner ved hjelp av samme rottekohort, som også systematisk sammenligner resultatene fra hver repetisjon. Repetisjoner kan brukes til å motvirke eksperimentelle forhold for å tillate sammenligning innen emne med redusert variasjon mellom tester. Den pålitelige gjentakelsen av oppgaven gjør at data kan samles, noe som betyr at tilstrekkelig stor mengde data kan genereres ved hjelp av et relativt lite antall rotter. Til slutt kan repetisjoner ved hjelp av samme rotte være gunstige i eksperimenter som involverer kirurgiske operasjoner og implantasjoner ved å senke antall rotter som kreves som følgelig sparer tid og arbeidskostnader.
Denne studien presenterer en omfattende protokoll som beskriver hvordan man utfører en objektplasseringsoppgave hos voksne rotter ved hjelp av sterke og svake kodingsforsøk etterfulgt av testforsøk med forsinkelser på 1 t og 24 timer. Den sterke kodingsprotokollen produserer statistisk signifikant anerkjennelsesminne når den testes med forsinkelser på 1 t og 24 timer og kan dermed brukes til å studere både kortsiktige og langsiktige minner ved implementering av manipulasjoner for å hemme disse minnene11. Den svake kodingsprotokollen gir derimot bare betydelig kortsiktig minne når den testes med en forsinkelse på 1 t. Fraværet av langsiktig minne kan brukes til å studere manipulasjoner for å forbedre oppbevaringen av minne11,12. Denne protokollen inneholder også detaljerte håndterings- og habituation-økter, som tar sikte på å øke replikerbarheten til objektplasseringsoppgaven. Dette dokumentet demonstrerer også gjentakelse av oppgaven i fire forskjellige sammenhenger med samme kohort av rotter ved hjelp av den svake kodingsprotokollen, som bekreftes å produsere repliserbare og konsistente resultater hver gang.
Objektplasseringsoppgaven kan brukes i en rekke studier for å undersøke romlig minne som beskrevet tidligere. Fleksibiliteten til oppsettet muliggjør modellering av kortsiktig og langsiktig minne av forskjellige styrker, og det kan enkelt implementeres til en lav pris. Men siden det er mange parametere i protokollen som kan påvirke resultatene, og forskjellige studier varierer litt i disse parametrene6, kan man få problemer med å implementere oppgaven for første gang. Protokollen ovenfor er ment å veilede leserne gjennom denne prosessen jevnt. Ytterligere viktige trinn som kan være viktige i vellykket implementering av oppgaven med høy replikerbarhet vil bli diskutert nedenfor.
Selv om kodings-/testøkten ofte er fokus når du kjører eksperimenter med objektplassering, har håndterings- og habituasjonsprotokoller en dyp effekt på utfallet av denne typen atferdstester der utfallet avhenger av uforstyrret naturlig rotteoppførsel14,15. Som sådan bør trinnene før kodingen / testøkten utformes med forsiktighet, da de kan påvirke rotteadferd og minne og følgelig påvirke sluttresultatene. Et godt nivå av håndtering og habituation slik at rotter blir kjent med eksperimentet, og oppgaven vil minimere effekten av stressfaktorer samtidig som sannsynligheten for å vise naturlig oppførsel8økes. Som nevnt i protokollen kan håndteringen begynne så tidlig som avvenning av valper hvis rottestammen opprettholdes i hjemmeanlegget. Basert på tidligere erfaring (data ikke vist) og fra flere tidligere studier16,17, resulterer denne tidlige håndteringen i lav angst og forbedret nysgjerrighet i månedene som følger.
Ettersom objektplasseringsoppgaven bare avhenger av rottenes iboende utforskende drivkraft, kan forventet oppførsel lett hindres hvis rotter ikke er ivrige etter å utforske eller motvillige til å nærme seg nyhet, som kalles ‘neofob oppførsel’1. Som sådan anbefales det på det sterkeste å inkludere en grundig håndterings- og habituasjonsprotokoll i henhold til studiens spesifikke behov. Denne protokollen kan brukes som en minimumskravguide, og ytterligere trinn kan implementeres (f.eks.hvis studien skal inkludere injeksjoner på et senere tidspunkt, er det nødvendig med habituation til injeksjonsprosedyrer og spesifikk holdeposisjon). Belastningen og alderen til de eksperimentelle rottene er to andre innflytelsesrike faktorer og bør vurderes før du planlegger et eksperiment for å unngå suboptimale resultater. Ulike rottestammer kan ha forskjellig atferd og baseline angstnivåer18,19,20 og derfor kan det være nødvendig med spesifikk justering av protokollen avhengig av belastningen som brukes.
Denne protokollen er bekreftet å fungere godt med Th-Cre transgene rotter med Long-Evans belastning tilbakekrysset fire ganger til Lister Hooded belastning og wild-type Lister Hette rotter. En logisk ideell startalder for rotter i atferdseksperimenter er rundt 12 uker20, men variasjon mellom belastninger og de spesifikke kravene til oppgaven bør redegjøres for. Det kan også være mulig å bruke utviklende rotter hvis det er av interesse for studien, selv om justeringer i protokollen kan være nødvendig og ikke dekkes her. Det er imidlertid viktig å vurdere om rotten i en gitt alder har utviklet de kognitive funksjonene som kreves for å kunne utføre denne oppgaven. En studie21 som undersøker dette har rapportert at bare ungdomsrotter på barseldag 38 og ikke før, viste allokentrisk romlig minne reflektert i preferanse for objekt på det nye stedet, som observert hos voksne rotter. Protokollen som presenteres her var vellykket ved hjelp av rotter som var 15-16 uker gamle i begynnelsen av den første kodingen / testøkten. Tidligere produserte den samme sterke kodingsprotokollen suboptimale til negative resultater ved bruk av 23 uker gamle rotter som ikke hadde nådd det optimale nivået av habituation på grunn av mangel på håndtering og habituating i ung nok alder. Disse rottene klarte enten ikke å utføre annerledes enn tilfeldig nivå eller faktisk viste aversjon mot nyhet som observert når det gjelder preferanse for de stabile objektene i stedet for de fordrevne objektene (data ikke vist). Disse resultatene gir bevis på at alderen og tidspunktet for håndteringen av habituation kan ha innvirkning på effektiviteten av habituation og som et resultat bidra til observasjon av engstelig og neofobisk oppførsel i testene.
Her skisseres to forskjellige protokoller, noe som sikrer sterk eller svak koding i objektplasseringsoppgaven. Under etableringen av disse protokollene ble det observert at interessen for objektene gikk ned etter 5-10 minutters utforskning under enkle lange forsøk(f.eks. 20 min koding), og rotter sluttet til slutt å utforske. Dette resulterer i svakere minne for objektplasseringene. En kodeprotokoll som innleder kodingsforsøk med korte hvileperioder(f.eks. 3 x 5 min koding) overvinner dette og fører til høy utforskning gjennom forsøkene. Dermed påvirker den aktive letetiden og den forskjellige utformingen av disse to kodingsprotokollene styrken til minnet, som er sterkere etter 3 x 5 min koding enn etter 20-minutters kodingsprotokoller. Lignende resultater kan også oppnås ved hjelp av litt forskjellige varigheter med enkeltforsøk kontra sammenflettede prøveprotokoller, og justeringer kan gjøres for å passe behovene til studien og rottestammen.
I motsetning til protokoller som bruker et vanlig hvitt åpent felt med bare eksterne signaler i rommet, bruker protokollen som presenteres her en arena med distinkte kontekster og intra-labyrint signaler som sannsynligvis krever mer tid til å lære. Derfor anbefales det å legge til et kontekstvanetrinn i protokollen før kodingsforsøket. Dette vil tillate rotter å danne et romlig kart over hver kontekst under habituation og redusere varigheten av følgende kodingsstudie, da rottene bare trenger å kode plasseringene til objektene i forhold til dette kartet. Videre vil kontekstvaneføring tillate rotter å habituate til enhver mulig distraktor i hver kontekst, for eksempel 3D romlige signaler, minimere atferd annet enn objektutforskning i kodingen / testøkten å følge. Med implementeringen av en grundig motvektsmetode som består av flere nivåer (dvs. et bredt spekter av objektplasseringskombinasjoner (tellere) og retning av objektforskyvningen), minimeres uønskede preferanser som kan stige på grunn av variasjoner i lysintensitet og veggfarger / mønstre i hjørnene av arenaen.
Flere faktorer bør vurderes når du gjentar oppgaven for å øke replikerbarheten mellom koding / testøkter og minimere påvirkningen av repetisjon. For det første må distinkte kontekster (så mange som antall repetisjoner av kodings-/testøkter) utformes for å unngå opphopning av romlig minne som kan være forårsaket av å utføre gjentatte økter i samme kontekst. For å oppnå dette ble det brukt et apparat med utskiftbare vegger av forskjellige farger og mønstre (Figur 1B,C). De distinkte veggene og 3D-objektene (for eksempel leker eller små hverdagsartikler med distinkte farger og former, se protokoll og figur 1C) hengt på veggene er de romlige signalene og landemerkene som rottene potensielt bruker til å lære objektplasseringer i forhold til deres kontekster. I tilfelle en test ikke klarer å produsere preferanse for det flyttede objektet, kan du vurdere å endre disse parametrene for konteksten (veggdesign og romlige signaler). Alternativt kan en rektangulær eller sirkulær arena brukes til objektplasseringsoppgaver i stedet for en firkantet arena som i denne protokollen. Sirkulære arenaer rapporteres å eliminere hjørnepreferanser22 som ofte observeres på arenaer med hjørner, og dermed kan det være gunstig når du arbeider med en spesielt høy angst rotte eller musestamme. Selv om kravene til å skape fire forskjellige kontekster i denne protokollen fungerer mest optimalt med en firkantet form, kan en sirkulær arena også gjøres funksjonell etter noen justeringer.
For det andre bør intervallene mellom hver koding / testøkt bestemmes slik at rotter beholder samme interessenivå hver gang, samtidig som de unngår risikoen for kumulativ læring som følge av en tett tidsplan for repetisjoner. Vanligvis er et intervall på minst dobbelt så lang forsinkelsestid mellom koding og testforsøk tilstrekkelig, med lengre intervaller som er gunstigere for mer enn to repetisjoner. Dette betyr at selv om et intervall på minimum 48 timer etter en 24-timers test er tilstrekkelig for en eller to repetisjoner, anbefales det å bruke et 1-ukers intervall for fire repetisjoner. Etter hvert som resultatene i figur 5 og sammenligningen ved hjelp av ANOVA viser, kan oppgaven gjentas fire ganger. Basert på dette kan den etablerte protokollen brukes til å motvirke opptil fire eksperimentelle forhold. Antall eksperimentelle grupper bestemmer antall repetisjoner av kodings-/prøveøkter i distinkte sammenhenger. Resultatene i figur 5 representerer en mulig måte å bruke protokollen på med to eksperimentelle grupper. Gruppene ble motvektet i to økter, og de samme betingelsene ble gjentatt i to ekstra økter (for valideringsformål). Det andre settet med motvektsøkter kan også brukes til å motvirke nye forhold. På samme måte kan tre eller fire eksperimentelle forhold sammenlignes med henholdsvis tre eller fire motvektsøkter.
I disse tilfellene bør kontekstene utformes for å imøtekomme kontrasterende egenskaper som er beskrevet i protokollen. Det er bemerkelsesverdig at den motvektede designen kanskje ikke er egnet for eksperimenter der ytterligere manipulasjoner, for eksempel en farmakologisk intervensjon som kan etterlate en langvarig effekt eller skade, skal brukes. For å opprettholde effektiviteten og replikerbarheten av testene, bør eksperimentet utformes tilsvarende. Dataene fra gjentatte tester kan presenteres og analyseres på flere måter, som vist i figur 5. For en innledende analyse kan de eksperimentelle gruppene i hver kontekst sammenlignes individuelt med tilfeldig nivå ved hjelp av t -testmed ett utvalg for å bestemme eventuelle signifikante preferanser (Figur 5B,D). Dette kan være nyttig for å få en rask forståelse av dataene, men det sikrer bare en indirekte sammenligning av gruppene. Så for å sammenligne to eller flere grupper, bør dataene analyseres ved hjelp av henholdsvis to-utvalgs t-tester (parvis eller uparret) eller ANOVA. Dette kan være i form av sammenligning mellom emne for gruppene i en enkelt kodings-/testøkt (Figur 4A og Figur 5B,D) eller sammenligning av gruppene innenfor emnet fra to (eller flere) motvektskontekster (Figur 5C,E). Sistnevnte metode anbefales sterkt, spesielt når du arbeider med svake minneforhold, som, som forklart tidligere, resulterer i høy varians på grunn av tilfeldighet i atferd.
Ved å kombinere de motvektskontekstene fører det til større grupper som kreves for å visualisere gruppens virkemåte på en pålitelig måte med minimal variasjon. Ved å bruke en protokoll med repetisjoner i motvektsøkter, kan man forvente en nedgang i antall rotter til rundt en tredjedel av tallet som kreves ved hjelp av en enkelt test med samme statistiske kraft. Vanligvis er prøvestørrelser i et område på 7 til 15 rotter (totalt) for motvektsøkter og i et område på 20 til 50 rotter (10 til 25 per gruppe) for en enkelt økt med en effektstørrelse og kraft som begge er større enn 0,8 tilstrekkelig. Nedgangen i antall dyr som trengs og økningen i informasjonen vi får fra hvert dyr ved hjelp av denne protokollen, foredler både studien og tjener 3R-prinsippene for etisk bruk av dyr i forskning. Det er viktig på dette trinnet å huske på at tilfeldig rotteadferd, som ikke er ledsaget av et sterkt minne, kan resultere i individuelle sterke preferanser både under og over tilfeldighet, men gruppegjennomsnittet bør gi en preferanse som ikke er vesentlig forskjellig fra tilfeldighetene. Individuelle data bør tolkes nøye. Fordelingen av individuelle datapunkter i en gruppe kan også være informativ for å tolke resultater. Som vist i figur 4 og figur 5, endres fordelingen avhengig av minnets styrke. Totalt sett kan protokollen som presenteres her enkelt følges for å implementere objektplasseringsoppgaven med repetisjoner for å modellere kortsiktig og / eller langsiktig romlig minne. Den enkle og fleksible treningsprotokollen og muligheten for å implementere ytterligere manipulasjoner gjør denne oppgaven til et populært valg. Disse endringene i protokollen gjør det mulig å undersøke bestemte trinn, for eksempel minneanskaffelse, konsolidering og tilbakekalling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara og David Bett for innsiktsfulle kommentarer og forslag. Denne studien ble støttet av Erasmus+ (til G.B. og L.N.); Graduate School of Health, Aarhus University (til K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) og PROMEMO – Senter for proteiner i minnet, et senter for fremragende forskning finansiert av Danish National Research Foundation (DNRF133) (til T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |