Perfilado de compuestos volátiles en fruta de grosella negra utilizando microextracción de fase sólida de headspace acoplada a cromatografía de gases-espectrometría de masas
Summary
Aquí se describe una plataforma de microextracción-gas-cromatografía de gases en fase sólida para una identificación y cuantificación volátil rápida, confiable y semiautomatizada en frutas maduras de grosella negra. Esta técnica se puede utilizar para aumentar el conocimiento sobre el aroma de la fruta y para seleccionar cultivares con sabor mejorado con el propósito de la cría.
Abstract
Existe un creciente interés en medir los compuestos orgánicos volátiles (COV) emitidos por las frutas maduras con el fin de mejorar variedades o cultivares con características organolépticas mejoradas y, por lo tanto, aumentar la aceptación del consumidor. Recientemente se han desarrollado plataformas metabolómicas de alto rendimiento para cuantificar una amplia gama de metabolitos en diferentes tejidos vegetales, incluidos los compuestos clave responsables del sabor y la calidad del aroma de la fruta (volatilomics). Aquí se describe un método que utiliza la microextracción de fase sólida del espacio de cabeza (HS-SPME) junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para la identificación y cuantificación de los COV emitidos por las frutas maduras de grosella negra, una baya muy apreciada por su sabor y beneficios para la salud.
Los frutos maduros de las plantas de grosella negra (Ribes nigrum) se cosecharon y congelaron directamente en nitrógeno líquido. Después de la homogeneización del tejido para producir un polvo fino, las muestras se descongelaron e inmediatamente se mezclaron con una solución de cloruro de sodio. Después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un vial de vidrio con espacio para la cabeza que contenía cloruro de sodio. Los COV se extrajeron utilizando una fibra de microextracción en fase sólida (SPME) y un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de iones. La cuantificación volátil se realizó en los cromatogramas iónicos resultantes mediante la integración del área de pico, utilizando un ion m/z específico para cada COV. La anotación correcta de COV se confirmó comparando los tiempos de retención y los espectros de masas de los estándares comerciales puros que se ejecutan en las mismas condiciones que las muestras. Se identificaron más de 60 COV en frutas maduras de grosella negra cultivadas en lugares europeos contrastantes. Entre los COV identificados, los compuestos aromáticos clave, como los terpenoides y los volátiles C6, se pueden utilizar como biomarcadores para la calidad de la fruta de grosella negra. Además, se discuten las ventajas y desventajas del método, incluidas las posibles mejoras. Además, se ha hecho hincapié en el uso de controles para la corrección de lotes y la minimización de la intensidad de la deriva.
Introduction
El sabor es un rasgo de calidad esencial para cualquier fruta, lo que afecta la aceptación del consumidor y, por lo tanto, afecta significativamente la comercialización. La percepción del sabor implica una combinación de los sistemas gustativo y olfativo y depende químicamente de la presencia y concentración de una amplia gama de compuestos que se acumulan en partes de plantas comestibles, o en el caso de los COV, son emitidos por la fruta madura1,2. Mientras que la cría tradicional se ha centrado en rasgos agronómicos como el rendimiento y la resistencia a las plagas, la mejora de los rasgos de calidad de la fruta, incluido el sabor, se ha descuidado durante mucho tiempo debido a la complejidad genética y la dificultad para fenotipar adecuadamente estas características, lo que lleva al descontento del consumidor3,4. Los avances recientes en plataformas metabolómicas han tenido éxito en la identificación y cuantificación de compuestos clave responsables del sabor y aroma de la fruta5,6,7,8. Además, la combinación de perfiles de metabolitos con herramientas genómicas o transcriptómicas permite dilucidar la genética subyacente al sabor de la fruta, lo que a su vez ayudará a los programas de mejoramiento a desarrollar nuevas variedades con características organolépticas mejoradas2,4,9,10,11,12,13,14.
Las bayas de grosella negra (Ribes nigrum) son muy apreciadas por su sabor y propiedades nutricionales, siendo ampliamente cultivadas en las zonas templadas de Europa, Asia y Nueva Zelanda15. La mayor parte de la producción se procesa para productos alimenticios y bebidas, que son muy populares en los países nórdicos, principalmente debido a las propiedades organolépticas de las bayas. El intenso color y sabor de la fruta son el resultado de una combinación de antocianinas, azúcares, ácidos y COV presentes en las frutas maduras16,17,18. El análisis de los volátiles de la grosella negra se remonta a la década de 196019,20,21. Más recientemente, varios estudios se han centrado en los COV de grosella negra, identificando compuestos importantes para la percepción del aroma de la fruta y evaluando el impacto del genotipo, el medio ambiente o las condiciones de almacenamiento y procesamiento en el contenido de COV5,17,18,22,23.
Debido a sus numerosas ventajas, la técnica de elección para el perfilado volátil de alto rendimiento es HS-SPME/GC-MS24,25. Una fibra de sílice, recubierta con una fase polimérica, se monta en un dispositivo de jeringa, lo que permite la adsorción de los volátiles en la fibra hasta que se alcanza una fase de equilibrio. La extracción del espacio de cabeza protege la fibra de los compuestos no volátiles presentes en la matriz24. SPME puede aislar con éxito un alto número de COV presentes en concentraciones muy variables (partes por billón a partes por millón)25. Además, es una técnica libre de disolventes que requiere un procesamiento de muestras limitado. Otras ventajas de HS-SPME son la facilidad de automatización y su costo relativamente bajo.
Sin embargo, su éxito puede ser limitado, dependiendo de la naturaleza química de los COV, el protocolo de extracción (incluyendo el tiempo, la temperatura y la concentración de sal), la estabilidad de la muestra y la disponibilidad de suficiente tejido frutícola26,27. Este artículo presenta un protocolo para COV de grosella negra aislados por HS-SPME y analizados por cromatografía de gases junto con un espectrómetro de masas de trampa de iones. Se logró un equilibrio entre la cantidad de material vegetal, la estabilidad de la muestra y la duración de la extracción y la cromatografía para poder procesar un alto número de muestras de grosella negra, algunas de ellas presentadas en este estudio. En particular, los perfiles de COV y/o cromatogramas de cinco cultivares (‘Andega’, ‘Ben Tron’, ‘Ben Gairn’, ‘Ben Tirran’ y ‘Tihope’) se presentarán y discutirán como datos de ejemplo. Además, el mismo protocolo se ha puesto en práctica con éxito para la medición de COV en otras especies de bayas de frutas como la fresa (Fragaria x ananassa), la frambuesa (Rubusidaeus) y el arándano (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
La cría para el aroma de la fruta se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por la compleja genética y bioquímica que subyace a la síntesis de compuestos volátiles y la falta de tecnologías para el fenotipado adecuado. Sin embargo, los recientes avances en plataformas metabolómicas, combinados con herramientas genómicas, están permitiendo finalmente la identificación de los metabolitos responsables de las preferencias de los consumidores y de criar cultivos con sabor mejorado3. Si b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación de la Universidad de Málaga las mediciones de HS-SPME/GC-MS. Agradecemos la asistencia de Sara Fernández-Palacios Campos en la cuantificación volátil. También agradecemos a los miembros del consorcio de GoodBerry por proporcionar el material de fruta.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
