Summary

Analyse van neutrale lipidesynthese in Saccharomyces cerevisiae door metabole etikettering en dunne laagchromatografie

Published: February 02, 2021
doi:

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de metabolische etikettering van gist met 14C-azijnzuur, dat wordt gekoppeld aan dunnelaagchromatografie voor de scheiding van neutrale lipiden.

Abstract

Neutrale lipiden (NLs) zijn een klasse van hydrofobe, chargeless biomoleculen die een sleutelrol spelen in energie en lipide homeostase. NLs worden gesynthetiseerd de novo van acetyl-CoA en zijn voornamelijk aanwezig in eukaryoten in de vorm van triglyceriden (TGs) en sterol-esters (SEs). De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van NLs zijn sterk geconserveerd van Saccharomyces cerevisiae (gist) op de mens, waardoor gist een nuttig modelorganisme is om de functie en regulering van NL-metabolismeenzymen te ontleden. Hoewel er veel bekend is over hoe acetyl-CoA wordt omgezet in een diverse set NL-soorten, worden er nog steeds mechanismen ontdekt voor het reguleren van NL-metabolismeenzymen en hoe verkeerde regulatie kan bijdragen aan cellulaire pathologieën. Gedurende tientallen jaren van onderzoek zijn tal van methoden voor de isolatie en karakterisering van NL-soorten ontwikkeld en gebruikt; een kwantitatief en eenvoudig protocol voor de alomvattende karakterisering van grote NL-soorten is echter niet besproken. Hier wordt een eenvoudige en aanpasbare methode gepresenteerd om de de novo synthese van belangrijke NL-soorten in gist te kwantificeren. We passen 14C-azijnzuur metabolische etikettering in combinatie met dunne laagchromatografie toe om een divers scala aan fysiologisch belangrijke NLs te scheiden en te kwantificeren. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast om in vivo reactiesnelheden van NL-enzymen of afbraak van NL-soorten in de loop van de tijd te bestuderen.

Introduction

Acetyl-CoA is de fundamentele bouwsteen van diverse biomoleculen, waaronder neutrale lipiden (NLs), die dienen als een veelzijdige biomoleculaire valuta voor het bouwen van membranen, het genereren van ATP en het reguleren van celsignalering1,2. De beschikbaarheid van NLs die in een van deze respectieve trajecten moeten worden gemeden, wordt gedeeltelijk gereguleerd door hun opslag. Lipidedruppels (LDs), cytoplasmatische organellen bestaande uit hydrofobe kernen van triglyceriden (TGs) en sterolesters (SE’s), zijn de belangrijkste opslagcompartimenten van de meeste cellulaire NLs. Als zodanig, LDs sequester en reguleren NLs, die kunnen worden afgebroken en vervolgens worden gebruikt voor biochemische en metabolische processen3,4. Het is bekend dat de verkeerde regulatie van NL- en LD-geassocieerde eiwitten gecorreleerd is met het begin van pathologieën waaronder lipodystrofie en metabool syndromen5,6. Hierdoor is het huidige LD-onderzoek intensief gericht op hoe NL-synthese ruimtelijk, tijdelijk en over verschillende weefsels van multicellulaire organismen wordt gereguleerd. Vanwege de alomtegenwoordige cellulaire rollen voor NLs, worden veel enzymen die verantwoordelijk zijn voor de synthese en regulering van NLs bewaard in eukaryoten7. Inderdaad, zelfs sommige prokaryoten slaan NLs op in LDs8. Daarom zijn genetisch trekbare modelorganismen zoals Saccharomyces cerevisiae (ontluikende gist) nuttig geweest voor de studie van NL-synthese en -regulatie.

De scheiding en kwantificering van NLs uit celextracten kan op talloze manieren worden bereikt, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) en ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS)9,10,11. Misschien is de eenvoudigste methode voor het scheiden van NLs via dunnelaagchromatografie (TLC), die latere densitometrische kwantificering mogelijk maakt van een standaardcurve12,13. Hoewel TLC slechts een koerskorrelige scheiding van NLs biedt, blijft het een krachtige techniek omdat het goedkoop is en het zorgt voor een snelle scheiding van NLs van meerdere monsters tegelijkertijd. Twee van de belangrijkste uitdagingen voor de studie van NLs via TLC zijn: 1) het brede scala aan cellulaire overvloed aan NL-soorten en hun tussenproducten, en 2) het bereik van hydrofielheid/hydrofobiciteit van lipide-tussenproducten binnen NL-syntheseroutes. Bijgevolg is de kwantificering van NL-soorten via TLC doorgaans beperkt tot de meest voorkomende soorten; de introductie van een 14C-azijnzuur radiolabel kan echter de detectie van tussenproducten met een lage overvloed binnen NL-trajecten aanzienlijk verbeteren. Azijnzuur wordt snel omgezet in acetyl-CoA door de acetyl-CoA synthetase ACS214, waardoor 14C-azijnzuur een geschikt radiolabeling substraat in gist15. Bovendien kan TLC zowel hydrofobe NLs als hydrofiele tussenproducten van NLs scheiden door het gebruik van meerdere oplosmiddelsystemen16. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de scheiding van NLs met behulp van 14C-azijnzuur metabolische etikettering in gist. Lipiden die tijdens de pulsperiode worden geëtiketteerd, worden vervolgens geïsoleerd door een goed vastgesteld totaal lipidenisolatieprotocol17, gevolgd door de scheiding van NL-soorten door TLC. Het ontwikkelen van TLC-platen door zowel autoradiografie om gelabelde lipiden te visualiseren, als een chemische spray om totale lipiden te visualiseren, maakt meerdere kwantificeringsmethoden mogelijk. Individuele lipidenbanden kunnen ook gemakkelijk uit de TLC-plaat worden gehaald met behulp van een scheermesje en scintillatietelling kan worden gebruikt om de hoeveelheid radioactief gelabeld materiaal in de band te kwantificeren.

Protocol

1. Groei en etikettering van gistcellen met 14C-azijnzuur Ent een gistcultuur in door een kolonie uit een bord te plukken en deze te doseren in 20 ml synthetische complete (SC) media die 2% dextrose bevatten (zie Aanvullend bestand voor het recept van SC-media). Incubeer bij 30 °C voor een nacht met schudden bij 200 tpm.OPMERKING: Groeiconditie, monstervolume en behandeling zullen verschillen op basis van de lipide(en) van belang. Voorafgaand aan volledige experimenten moeten op…

Representative Results

In dit protocol hebben we aangetoond dat het labelen, detecteren en kwantificeren van NL-soorten kan worden bereikt door 14C-azijnzuur metabolische etikettering. Grote NL-soorten kunnen worden gescheiden in een oplosmiddelsysteem van 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexaan:Petroleumether:Diethylether:Azijnzuur (Figuur 1A,B). Fosforbeeldvorming maakt visualisatie mogelijk van gelabeld vrij vetzuur (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), cholesterol (Chol) en squalee…

Discussion

Hier wordt een veelzijdig radiolabeling protocol gepresenteerd om de synthese van NL soorten in gist kwantitatief te monitoren. Dit protocol is zeer modulair, waardoor de procedure binnen 3-6 dagen kan worden voltooid. Bovendien bestaat er een schat aan literatuur over het gebruik van TLC om lipidesoorten en metabolieten te scheiden, waardoor de gebruiker verschillende soorten lipiden van belang zou moeten kunnen detecteren met een eenvoudige wijziging van TLC-oplosmiddelsystemen16,<sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de leden van het Henne lab bedanken voor hulp en conceptueel advies bij de afronding van dit onderzoek. W.M.H. wordt ondersteund door fondsen van de Welch Foundation (I-1873), het NIH NIGMS (GM119768), het Ara Paresghian Medical Research Fund en het UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R. is ondersteund door een T32-programmasubsidie (5T32GM008297).

Materials

[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi PerkinElmer NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol Avanti 800811O
200 proof absolute ethanol Sigma 459836
Acid washed glass beads 425-600um Sigma G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes Fisher 03-448-24
Ammonium Sulfate >99% Sigma A4418
Beckman LS6500 scintillation counter PerkinElmer A481000
Chloroform (HPLC grade) Fisher C607SK
Cholesterol >99% Sigma C8667
Cholesteryl-linoleate >98% Sigma C0289
Concentrated sulfuric acid Sigma 339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap Sigma CLS430829
Dextrose, anhydrous grade Sigma D9434
Diethyl ether anhydrous grade Sigma 296082
Drying oven Fisher 11-475-155
EcoLume scintillation liquid VWR IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge Fisher 05-401-205
GE Storage phosphor screen Sigma GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade Sigma 695092
Glass 6mL scintillation vials Sigma M1901
Glass centrifuge tube caps Fisher 14-595-36A
Glass centrifuge tubes Fisher 14-595-35A
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20C
Hexane, anhydrous grade Sigma 296090
L-Adenine >99% Sigma A8626
L-Alanine >98% Sigma A7627
L-Arginine >99% Sigma A1270000
L-Asparagine >98% Sigma A0884
L-Aspartate >98% Sigma A9256
L-Cysteine >97% Sigma W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% Sigma 49621
L-Glutamine >99% Sigma G3126
L-Glycine >99% Sigma G8898
L-Histidine >99% Sigma H8000
L-Isoleucine >98% Sigma I2752
L-Leucine >98% Sigma L8000
L-Lysine >98% Sigma L5501
L-Methionine, HPLC grade Sigma M9625
L-Phenylalanine, reagent grade Sigma P2126
L-Proline >99% Sigma P0380
L-Serine >99% Sigma S4500
L-Theronine, reagent grade Sigma T8625
L-Tryptophan >98% Sigma T0254
L-Tyrosine >98% Sigma T3754
L-Uracil >99% Sigma U0750
L-Valine >98% Sigma V0500
Methanol, ACS grade Fisher A412
Oleic acid >99% Sigma O1008
p-anisaldehyde Sigma A88107
Petroleum ether, ACS grade Sigma 184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% Sigma P1652
Pipettes Eppendorf 2231000713
Potassium chloride, ACS grade Sigma P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS Fisher S318-100
Squalene >98% Sigma S3626
Succinic Acid crystalline/certified Fisher 110-15-6
TLC saturation pad Sigma Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate Fisher NC9825743 No fluorescent indicators
Transparency plastic film Apollo 829903
Tricine Sigma T0377
Triolein >99% Sigma T7140
Vortex mixer Fisher 02-215-414
Whatman exposure cassette Sigma WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids Sigma Y1251

References

  1. Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
  2. Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
  3. Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
  4. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  5. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  6. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
  7. Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
  8. Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
  9. Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
  10. Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
  11. Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
  12. Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
  13. Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
  14. Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
  15. Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
  16. Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  18. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
  19. Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Play Video

Cite This Article
Rogers, S., Henne, W. M. Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (168), e62201, doi:10.3791/62201 (2021).

View Video