Un test sur plaque pour la mesure de la libération endogène de monoamine dans les tranches cérébrales aiguës

Une pléthore de maladies neurologiques et psychiatriques sont associées à un dérèglement ou à un entretien insuffisant du neurotransmetteur monoamine (dopamine [DA], sérotonine [5-HT], noradrénaline [NE]) homéostasie1,2,3. Ces conditions comprennent, sans toutefois s’y limiter, la ^{dépression1,2}, la ^{schizophrénie2}, l’anxiété2, la ^dépendance4, la ménopause5,6,7, la ^douleur8 et la maladie de ^Parkinson3. Par exemple, plusieurs modèles de ménopause chez le rat ont montré que le dérèglement ou la réduction des monoamines dans l’hippocampe, le cortex préfrontal et le striatum peut être associé à la dépression et au déclin cognitif, ce qui est observé chez les femmes ménopausées. La dérégulation des monoamines dans ces modèles a été largement examinée à l’aide de HPLC-ECD, bien que les études n’aient pas fait de distinction entre la teneur mesurée en neurotransmetteurs et la libération de neurotransmetteurs5,6,7. Les monoamines sont classiquement libérées dans l’espace extracellulaire par libération vésiculeuse dépendante du ^Ca2+9 et sont recyclées par leur système de recapture de la membrane plasmique respectif (transporteur de dopamine, DAT; transporteur de sérotonine, SERT; transporteur de noradrénaline, NET)^10,11. Inversement, les données suggèrent que ces transporteurs sont capables de libérer ou d’efflux des monoamines, puisque les drogues d’abus telles que l’amphétamine (AMPH) et la 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA) sont connues pour libérer du DA et du 5-HT, respectivement par le biais de leurs systèmes de ^{transport12,13,14,15,16,17} . Ainsi, une bonne compréhension mécaniste de la dynamique de libération de monoamine est cruciale pour développer des pharmacothérapies spécifiques et ciblées.

Un large éventail de techniques ont été utilisées pour étudier la libération de monoamines telles que la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV)¹⁸, la microdialyse in ^vivo13, l’imagerie19, la préincubation avec des monoamines radiomarquées20, l’optogénétique et, plus récemment, les capteurs fluorescents et la photométrie génétiquement ^codés21,22 . Le FSCV et la microdialyse in vivo sont les principales techniques utilisées pour étudier la libération de monoamines. Le FSCV est utilisé pour étudier la libération exocytotique stimulée de DA principalement dans les tranches cérébrales aiguës et in ^vivo23. Étant donné que le FSCV utilise des électrodes pour stimuler ou évoquer la libération, la principale source de libération de neurotransmetteurs est la libération vésiculeuse dépendante du ^{Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31} . La microdialyse in vivo couplée à la CLHP mesure les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires à l’aide d’une sonde placée dans une zone d’intérêt ^{cérébral13,32}. Comme pour le FSCV, une limitation majeure de la microdialyse in vivo est la difficulté de déterminer la source de libération de neurotransmetteurs: libération vésiculeuse dépendante de ^Ca2+ ou dépendante du transporteur. Il convient de noter que les deux méthodes permettent de mesurer directement la libération de monoamine. Grâce aux progrès récents de l’optogénétique, la recherche démontre la détection de la libération de 5-HT et de DA dans un court laps de temps avec une spécificité de type cellulaire ^exquise21,22. Cependant, ces stratégies nécessitent des techniques et de l’équipement complexes et coûteux, et mesurent indirectement la libération de monoamine, en particulier par la liaison de la monoamine aux récepteurs. En outre, les monoamines radiomarquées sont également utilisées pour étudier la dynamique des monoamines. Les monoamines radiomarquées peuvent être préchargées dans divers systèmes modèles tels que les cellules hétérologues surexprimant chaque transporteur de monoamine20,33,34,35,36,37,38,39,40, les neurones ^primaires20, les synaptosomes33,39,41^{, 42}, et des tranches de cerveau ^aiguës43,44. Cependant, la radioactivité présente des dommages potentiels pour l’expérimentateur, et les analytes marqués au tritium peuvent ne pas récapituler fidèlement la dynamique endogène de la ^{monoamine45,46}. Les systèmes de superfusion combinés à des méthodes de détection hors ligne telles que HPLC-ECD ont permis la détection de monoamines provenant de sources tissulaires multiples. Ici, ce protocole fournit une méthode optimisée et peu coûteuse, simple et précise utilisant des tranches cérébrales aiguës pour mesurer directement la libération endogène basale et stimulée de monoamine.

Les tranches cérébrales aiguës permettent de tester des hypothèses mécanistes, principalement car elles préservent le microenvironnement anatomique in vivo et maintiennent intactes les synapses47,48,49,50,51,52. Dans quelques études, des tranches cérébrales aiguës ou du tissu cérébral haché ont été utilisés en conjonction avec une technique de superfusion utilisant KCl pour stimuler la libération médiée par ^Ca2+53,54,55,56. Les systèmes de superfusion ont été essentiels pour faire progresser la compréhension du domaine des mécanismes de libération de neurotransmetteurs, y compris les monoamines. Cependant, ces systèmes sont relativement coûteux et le nombre de chambres disponibles pour l’analyse des tissus varie de 4 à 12. En comparaison, la méthode présentée ici est peu coûteuse, permet la mesure de 48 échantillons de tissus et peut être affinée pour utiliser jusqu’à 96 échantillons de tissus. Chaque puits dans la plaque de 48 puits contient des porte-tissus qui utilisent des filtres pour séparer le produit libéré du tissu, et les monoamines libérées sont ensuite collectées et analysées par HPLC-ECD. Il est important de noter que cette méthode permet de mesurer simultanément la libération de 5-HT, DA et NE de différentes zones du cerveau telles que le cortex préfrontal, l’hippocampe et le striatum dorsal après traitement avec des agents pharmacologiques qui modulent la libération de monoamine. Ainsi, l’expérimentateur peut répondre à plusieurs questions à l’aide d’un système multi-puits peu coûteux qui augmente le nombre d’échantillons testés et réduit ainsi le nombre d’animaux utilisés.