Summary

Бесконтактная модель кокультуры для изучения активации врожденных иммунных клеток во время респираторной вирусной инфекции

Published: February 28, 2021
doi:

Summary

Этот протокол подробно описывает исследование ранних взаимодействий между вирусно инфицированными эпителиальными клетками носа и активацией врожденных клеток. Отдельные подмножества иммунных клеток можно выделить на основе их активации в ответ на вирусные инфекции. Затем они могут быть дополнительно исследованы, чтобы определить их влияние на ранние противовирусные реакции.

Abstract

Ранние взаимодействия между эпителиальным слоем носа и врожденными иммунными клетками во время вирусных инфекций остаются недостаточно изученной областью. Значение передачи сигналов врожденного иммунитета при вирусных инфекциях значительно возросло, поскольку пациенты с респираторными инфекциями, которые демонстрируют высокую врожденную активацию Т-клеток, показывают лучший исход заболевания. Следовательно, препарирование этих ранних врожденных иммунных взаимодействий позволяет прояснить процессы, которые ими управляют, и может способствовать разработке потенциальных терапевтических целей и стратегий для ослабления или даже предотвращения раннего прогрессирования вирусных инфекций. Этот протокол детализирует универсальную модель, которая может быть использована для изучения ранних перекрестных помех, взаимодействий и активации врожденных иммунных клеток из факторов, секретируемых вирусно инфицированными эпителиальными клетками дыхательных путей. Используя вирус гриппа H3N2 (A/Aichi/2/1968) в качестве репрезентативной модели вируса, врожденная клеточная активация совместно культивируемых мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) была проанализирована с использованием проточной цитометрии для исследования подмножеств клеток, которые активируются растворимыми факторами, высвобождаемыми из эпителия в ответ на вирусную инфекцию. Результаты демонстрируют стратегию дифференциации подмножеств клеток и выявляют четкие различия между активированными популяциями PBMCs и их перекрестными помехами с контрольным и инфицированным эпителием. Затем активированные подмножества могут быть дополнительно проанализированы для определения их функций, а также молекулярных изменений, специфичных для клеток. Результаты такого перекрестного исследования могут выявить факторы, которые важны для активации жизненно важных врожденных клеточных популяций, которые полезны для контроля и подавления прогрессирования вирусной инфекции. Кроме того, эти факторы могут быть повсеместно применены к различным вирусным заболеваниям, особенно к вновь возникающим вирусам, чтобы ослабить воздействие таких вирусов, когда они впервые циркулируют в наивных человеческих популяциях.

Introduction

Респираторные вирусы, пожалуй, являются одними из наиболее распространенных патогенов, вызывающих серьезное медицинское и экономическое бремя. От периодических глобальных вспышек новых эпидемических штаммов (например, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) до сезонных штаммов гриппа каждый год, вирусы представляют постоянную угрозу для здоровья населения. Хотя вакцины составляют основную часть ответных мер на эти глобальные проблемы общественного здравоохранения, отрезвляюще отметить, что эти контрмеры являются просто ответными 1,2. Кроме того, задержка между появлением нового инфекционного штамма и успешной разработкой его вакцины неизбежна3, что приводит к периоду, когда меры, доступные для сдерживания распространения вируса, сильно ограничены.

Эти задержки еще более подчеркиваются издержками, которые наносятся обществу как в экономическом, так и в социальном плане. Только сезонный грипп несет ответственность за примерно 8 миллиардов долларов косвенных расходов, 3,2 миллиарда долларов медицинских расходов и 36,3 тысячи смертей в Соединенных Штатах Америки ежегодно4. Это до рассмотрения расходов на исследования, которые необходимы для финансирования разработки вакцины. Эпидемические вспышки имеют еще более серьезные последствия для общества, усугубляемые растущими темпами глобализации с каждым годом, о чем свидетельствуют глобальные сбои, вызванные возникновением и быстрым распространением тяжелого острого респираторного синдрома короновируса 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Недавние исследования показали, что инфицированные пациенты, имеющие большую популяцию активированных врожденных Т-клеток, как правило, имеют лучший исход заболевания 8,9,10. Кроме того, врожденная популяция Т-клеток подразделяется на несколько подгрупп: слизисто-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT), Vδ1 γδ Т-клетки, Vδ2 γδ Т-клетки и естественные Т-киллеры (NKT). Эти подгруппы врожденных Т-клеток также демонстрируют гетерогенность в своих популяциях, увеличивая сложность взаимодействий между клеточными популяциями, участвующими во врожденном иммунном ответе11. Следовательно, механизм, который активирует эти врожденные Т-клетки и знание конкретных подгрупп врожденных Т-клеток, может обеспечить другое направление исследований для ограничения инфекционного воздействия этих вирусов на человека-хозяина, особенно в период разработки вакцины.

Эпителиальные клетки, инфицированные гриппом, продуцируют факторы, которые быстро активируют врожденные Т-клетки 12,13,14. Основываясь на этом открытии, эта бесконтактная модель кокультуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) направлена на имитацию ранних химических взаимодействий (опосредованных растворимыми факторами, высвобождаемыми инфицированным эпителиальным слоем) между инфицированным носовым эпителиальным слоем и НБМК во время ранней инфекции. Физическое разделение между носовым эпителиальным слоем (культивируемым на мембранных вставках) и PBMCs (в камере внизу) и целостность эпителия предотвращают прямую инфекцию PBMCs вирусом, что позволяет детально изучить влияние эпителиальных растворимых факторов на PBMCs. Поэтому выявленные факторы могут быть дополнительно исследованы на предмет их терапевтического потенциала в индуцировании соответствующей врожденной популяции Т-клеток, которая может защитить от инфекции гриппа. Поэтому в этой статье подробно описаны методы создания кокультуры для изучения врожденной активации Т-клеток из растворимых факторов, полученных из эпителия.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты носителей, используемых в этом протоколе, приведены в Таблице 1 .ПРИМЕЧАНИЕ: было обнаружено, что hNECS, выращенные на 12-луночной трансвелле, вырастают в более оптимальную толщину для того, чтобы растворимые факторы легко достигали базальной камеры при зараж…

Representative Results

Хотя обычные Т-клетки образуют основной репертуар адаптивного иммунного ответа против вирусной инфекции для облегчения вирусного клиренса, врожденная популяция Т-клеток работает по всему более широкому спектру, чтобы подавить вирусную нагрузку для эффективного кли…

Discussion

Врожденные иммунные реакции против вирусов являются недостаточно изученной областью исследований в области противовирусного лечения. Эпителиальные клетки дыхательных путей и врожденные иммунные клетки работают согласованно, чтобы подавить репликацию вируса во время инфекции, поми…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить научных сотрудников кафедры отоларингологии NUS и кафедры микробиологии и иммунологии за их помощь в работе, связанной с культурой hNEC и вирусной культурой. Мы также хотели бы поблагодарить хирургов и хирургическую бригаду в Национальной университетской больнице, отделение отоларингологии, за их помощь в предоставлении образцов клеток и крови, необходимых для исследования.
Это исследование финансировалось Национальным советом по медицинским исследованиям, Сингапур No. NMRC/CIRG/1458/2016 (Де Юн Вану) и MOH-OFYIRG19may-0007 (Кай Сен Тану). Кай Сен Тан является получателем стипендиальной поддержки от Европейской исследовательской стипендии по аллергии и клинической иммунологии (EAACI) 2019 года.

Materials

0.5% Trypsin-EDTA Gibco 15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free Thermofisher AM9260G 0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120086 1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes BD 366643 10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS Gibco 14200-075
10x PBS Vivantis PC0711
12-well Plate Corning  3513
12-well Transwell Insert Corning  3460 membrane insert
1x FACS Lysing Solution BD 349202
2.0 mL SafeLock Tubes Eppendorf 0030120094 2 mL centrifuge tube
24-well Plate Corning  3524
24-well Transwell Insert Corning  3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue STEMCELL Technologies 07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine Sigma T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O Sigma 533998
5810R Centrifuge Eppendorf 5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes) BD 352058
70 µm Cell Strainer Corning  431751
A-4-62 Rotor Eppendorf 5810709008
Accutase Gibco A1110501 Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Avicel CL-611 FMC Biopolymer NA Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software Bio-Rad Laboratories, Inc 171STND01 Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G BD 367287
Cholera Toxin Sigma C8052
Crystal Violet  Merck C6158
Cytofix/Cytoperm Solution BD 554722 Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II Sigma D4693 Neutral Protease
DMEM/High Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12 Gibco-Invitrogen 11320033
dNTP Mix Promega U1515 dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine) ATCC 30-2003
EVOM voltohmmeter device WPI, Sarasota, FL, USA 300523
FACS Lysing Solution BD 349202 1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL CellStar 188271 15 mL tube
Falcon tube 50 mL CellStar 227261 50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master Roche 6402682001 qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium Research Instruments 17544203 Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)  ATCC VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence Sigma 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence Sigma 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Gibco 10500-064
hNESPCs Human Donors NA
Human Epithelial Growth Factor Gibco-Invitrogen PHG0314
Hydrocortisone STEMCELL Techonologies 7925 Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin Sigma I3536
Lightcycler 96 Roche 5815916001 qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation Thermofisher L23105 Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II – Premixed 23 Plex Merck Pte Ltd HCP2MAG-62K-PX23 Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C Sigma M4287
M-MLV 5x Buffer Promega M1705 RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase Promega M1706 Reverse Transcriptase
N-2 supplement Gibco-Invitrogen 17502-048
NIH/3T3 ATCC CRL1658
Perm/Wash Buffer BD 554723 Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Basal Medium STEMCELL Techonologies 5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x) STEMCELL Techonologies 5001
Random Primers Promega C1181 Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor Promega N2511 RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer Qiagen Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine) ATCC 30-2001
STX2 electrodes WPI, Sarasota, FL, USA STX2 Electrode
T25 Flask Corning 430639
T75 Flask Corning 430641U
TPCK Trypsin Sigma T1426
Trypan Blue Hyclone SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit Qiagen 52904 Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate Corning 3894

References

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364 (2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132 (2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak – an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11 (2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653 (2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706 (2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514 (2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986 (2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685 (2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay (2020)
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130 (2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

Play Video

Cite This Article
Lew, Z. Z. R., Liu, J., Ong, H. H., Tan, V. J., Luukkainen, A., Ong, Y. K., Thong, M., Puan, K. J., Chow, V. T. K., Tan, K. S., Wang, D. Y. Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection. J. Vis. Exp. (168), e62115, doi:10.3791/62115 (2021).

View Video