Summary

音響浮上システムにおける非球面気泡振動によるマイクロストリーミングの誘導

Published: May 09, 2021
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Summary

2つの気泡間の合体技術に基づく単一のトラップ音響気泡の形状振動を制御するための高速で信頼性の高い技術が提案されています。定常状態で対称的に制御された気泡形状振動により、気泡界面近傍で発生する流体の流れを解析できます。

Abstract

生物学的障壁の近くに位置する場合、振動するマイクロバブルは細胞膜透過性を高め、薬物および遺伝子の内在化を可能にする可能性がある。実験的観察は、これらの障壁の一時的な透過処理が、キャビテーションマイクロストリーミングによって細胞組織に及ぼされるせん断応力によるものである可能性があることを示唆している。キャビテーションマイクロストリーミングは、振動する超音波マイクロバブルの周りに発生する渦流の生成です。このような液体の流れを生成するには、気泡振動が純粋に球面振動から逸脱し、並進不安定性または形状モードのいずれかを含む必要があります。気泡誘起流れや近傍表面におけるせん断応力の実験的研究は、マイクロバブルの形状変形を安定して制御して捉えることが難しいため、その範囲が限定されることが多い。対称制御された非球面振動の研究のための音響浮上室の設計について説明します。このような制御は、十分に強い超音波場において2つの接近気泡間の合体技術を使用することによって行われる。非球面振動の制御は、自由表面振動マイクロバブルの制御されたキャビテーションマイクロストリーミングへの道を開きます。高フレームレートカメラは、音響時間スケールでの非球面気泡ダイナミクスと、より低い時間スケールでの液体の流れを準同時に調査することができます。多種多様な流体パターンが得られ、それらが気泡界面のモード含有量と相関していることを示しています。界面ダイナミクスに複数のモードが含まれていれば、高次形状モードでも長距離の流体パターンを作成できることを示し、標的および局所的な薬物送達のための非球面振動の可能性を強調しています。

Introduction

医学では、投与された薬物は、所望の標的に到達する前に、生体系の多くの障害物を貫通しなければならない。しかし、ほとんどの薬は血流から急速に取り除かれます。ターゲティング効率が低く、細胞膜を容易に通過できないため、薬物送達が効果がありません。現在、マイクロバブルと超音波の組み合わせは、病理学的組織および細胞への薬物および遺伝子の非侵襲的、正確かつ標的化された送達のための革新的な方法として提案されている1。このアプローチでは、マイクロバブルは、遊離薬物が気泡懸濁液と同時注入されるか、またはその表面に装填される担体としての役割を果たすことができる。マイクロバブルは、細胞と相互作用するために超音波エネルギーを再集束させるための局所ベクトルとしても作用することができる。基本的に、超音波照射下では、気泡は安定して圧縮および膨張し、液体の流れを生成し、したがって近くの物体にせん断応力を発生させる安定キャビテーションと呼ばれる体制である。マイクロバブルはまた、慣性キャビテーションの領域で非線形に振動し、崩壊するまで膨張し、崩壊部位2から放射状に伝播する衝撃波を生成する可能性があります。安定または慣性のいずれかのキャビテーションは、細胞膜の透過処理を促進し、したがって細胞内への薬物の内在化を促進することが示されている3

治療用途では、気泡と細胞の相互作用のメカニズムを理解することは非常に重要ですが、科学的側面と技術的側面の両方から、私たちの知識の進歩を妨げるいくつかの障壁があります。まず、気泡が誘発する機械的刺激に応答する細胞の動態を捉えることは非常に困難です4。音響時間スケールでは、一次マイクロバブル振動は膜チャネルの活性化につながり、生物学的界面を横切る分子通過を促進することができます。これは、「細胞マッサージ」5とも呼ばれる細胞膜の直接振動によって起こります。直接的な機械的ストレス後のチャネル活性化は、超音波曝露中および曝露後の細胞膜の電気生理学的特性を測定するパッチクランプ技術を使用して証明されました6。気泡誘起細胞動態(細胞膜の変形の完全な場を意味する)を音響タイムスケールで測定することは、細胞膜7に孔を誘導するために必要な膜面積拡大ΔA / Aの閾値に関する洞察も提供するであろう。第2の障壁は、マイクロバブルによる細胞溶解を回避するために、崩壊する気泡レジームを制御することです。気泡崩壊と誘起マイクロジェットは、膜穿孔が起こるメカニズムとして同定されています8,9。透過処理されると、細胞膜は脂質二重層のカルシウム自己封鎖および細胞内小胞の融合によって修復される9。気泡崩壊の発生はまた、細胞に致命的な損傷を引き起こし、周囲の細胞に不必要な副作用を引き起こす可能性があります。超音波を介した血液脳関門開口部などの敏感なアプリケーションでは、慣性気泡の崩壊を避けるべきであると一般に認められています10

したがって、マイクロバブル11の安定した振動を確保するために、パッシブキャビテーションの監視および制御と相まって、超音波放出シーケンスの設計に現在多大な努力が払われている。この安定な領域において、安定に振動する気泡は、細胞膜7上の空間的に標的化されたせん断応力を促進することによって、膜透過処理の誘発に強い役割を果たすという仮説が立てられている。せん断応力は、振動する気泡の近傍で発生する液体の流れから生じます。これらの液体の流れはキャビテーションマイクロストリーミングと呼ばれ、前述のように、細胞外分子の取り込みの促進に関与するいくつかの可能なメカニズムの1つです。インビトロ生物学的トランスフェクションアッセイ12のような気泡または細胞の懸濁液を扱う場合、マイクロストリーミングによる透過処理は、気泡崩壊による透過処理よりもはるかに効率的であり得る。これは、単純な幾何学的考察によって示すことができます。細胞懸濁液では、懸濁細胞の大部分が十分に大きな機械的効果(膜透過処理につながる)に服従する場合、ソノポレーションは効率的になります。気泡崩壊は、気泡壁軸13 や気泡-気泡と気泡セル線がそれらの重心14を結合するような等方対称性の破れ方向に沿って方向付けられることが知られている。したがって、生成されたマイクロジェットは、細胞の中心と気泡の中心を結ぶ有限数の線に沿った空間的に局在する現象です。細胞および気泡濃度、ならびに気泡-細胞間距離によっては、この効果は、浮遊細胞の総数を透過させるのに最も効率的ではない場合があります。対照的に、キャビテーションマイクロストリーミングは、気泡半径に比べて大きな空間膨張を伴う、遅い時間スケールで発生する現象です。また、液体の流れは気泡の周囲全体に分布しているため、非常に長い範囲でより多くのセルに影響を与える可能性があります。したがって、振動気泡の周囲に発生するキャビテーションマイクロストリーミングを理解することは、細胞に加えられる気泡誘起せん断応力を制御および定量化するための前提条件です。

そうするために、予備ステップは、生成された液体の流れが気泡界面1516の運動によって誘導されるので超音波駆動気泡の球状および非球形振動を制御することからなる。特に、マイクロバブルの形状振動をトリガーし、安定に保つ必要があります。さらに、気泡界面ダイナミクスと誘起マイクロストリーミングパターンとの相関を適切に解析するために、気泡形状振動の向きを制御する必要があります。既存の文献を要約すると、キャビテーション誘起マイクロストリーミングの詳細な実験結果は、表面に付着した気泡についてのみ利用可能であることは明らかです。壁に取り付けられたマイクロバブルは、超高速顕微鏡システムの下でマイクロメートルスケールで正確な界面ダイナミクスと細胞相互作用を評価するために一般的に使用されます。この構成は、細胞膜171819上に位置する振動性マイクロバブルを考慮する場合に治療的に関連する。しかし、基板付着気泡の研究は、接触線ダイナミクス20の複雑な性質と非対称形状モード21のトリガーのために、気泡ダイナミクスの分析をより複雑にする可能性があります。医療および生物学的用途では、壁に付着していない気泡は、小さな容器などの限られた形状によく見られます。これは、気泡のダイナミクスと形状の不安定性に大きな影響を与えます。特に、近くの壁の存在は、形状モードトリガの圧力閾値を、形状モード数および気泡サイズ22に応じてより低い圧力値にシフトする。壁はまた、気泡誘起マイクロストリーミングにも影響を及ぼし、生成された流れ23に対しておそらくより高い強度を有する。

マイクロバブルが経験する可能性のあるすべてのシナリオ(自由または付着、壁の近く、崩壊または安定して振動)の中で、境界から遠く離れた単一の気泡の非球面ダイナミクスを調査することを提案します。実験セットアップは、気泡をトラップするために定在超音波が使用される音響浮上システム24に基づいている。このシナリオは、例えば、浮遊気泡と細胞の集合体がソノトランスフェクションチャンバー内に共存する医療アプリケーションと一致している。気泡と細胞が近すぎない限り、細胞の存在は気泡界面のダイナミクスに影響を与えないと仮定される。細胞がキャビテーション誘起マイクロストリーミングのループ状の軌跡をたどるとき、それらは周期的に気泡位置から接近して反発しており、細胞の存在はストリーミングパターンとその平均速度に影響を与えないと考えることができます。また、境界から遠く離れた単一気泡からの非球面ダイナミクスや誘起マイクロストリームは、理論的な観点からもよく知られています。気泡誘起液体の流れを気泡輪郭ダイナミクスにリンクさせるためには、気泡界面ダイナミクスを正確に特徴付ける必要があります。そのためには、治療に用いるものに対して時空間スケールを適応させ、一般的な高速度カメラ(100万フレーム/秒以下)で、低周波数で励起された大きな気泡を用いて取得できるようにすることが好ましい。コーティングされていない気泡を考える場合、与えられたモードnの固有周波数ωnは、25としてEquation 1気泡サイズに関係します。この半径-固有周波数関係は、殻付き気泡26を考えると若干修正されるが、固有振動数ωnの大きさの程度は変わらない。したがって、30kHzの超音波場で平衡半径~50μmの気泡を調べることは、Dolletらによって提案されたように、1.7MHzの磁場で半径~3μmのコーティングされた気泡を研究することに似ています27。したがって、同様の形状モード番号、したがってマイクロストリーミングパターンが予想されます。

気泡界面の非球面振動をトリガするには、図1に示すように、半径に依存する特定の圧力閾値を超える必要があります。既存の実験技術は、段階的な圧力上昇28または表面モードの周期的な開始と消滅の原因となる変調振幅励起29のいずれかによって、表面モードをトリガーするための音圧の増加に依存しています(図1の経路(1)で示されています)。これらの技術の主な欠点は、(i)表面振動の対称軸のランダムな配向が結像面にあるように制御できないこと、(ii)気泡形状振動の寿命が短いため、より大きなタイムスケールで誘導された液体の流れの分析が困難になること、および(iii)不安定な形状モードが頻繁にトリガーされることです。図1の経路(2)に示すように、半径/圧力マップで一定の音圧で圧力しきい値を超える代替手法を提案します。そのためには、不安定ゾーンになるようにバブルサイズを大きくする必要があります。このような増加は、気泡合体技術によって行われる。最初は球状に振動する2つのマイクロバブルの合体を利用して、1つの変形気泡を作成します。合体気泡の音圧と気泡サイズが不安定ゾーンにある場合、サーフェスモードがトリガーされます。また、合体法が定常状態で安定した形状振動を誘起し、接近する2つの気泡の直線運動によって定義される対称軸を制御することも証明しました。安定した形状振動が数分にわたって確保されるため、薄いレーザーシートで照明された蛍光微粒子を液体媒体に播種することにより、気泡誘起流体の流れの分析が可能です。気泡界面近傍における固体微粒子の運動を記録することは、誘導流体流30のパターンを識別することを可能にする。気泡形状振動のトリガーの全体的な原理は、時間的に安定した流体の流れにつながることを図2に示します。

以下のプロトコルでは、合体技術を介して安定した気泡形状の振動を作成するために必要な手順の概要を説明し、流体の流れの測定について説明します。これには、音響浮上システムの設計、音響キャリブレーション、気泡核生成および合体技術、気泡界面ダイナミクスおよび周囲の流体流の測定、および画像処理が含まれます。

Protocol

1.音響浮上室の設計 マルチフィジックスシミュレーションソフトウェア(材料表)のジオメトリモジュールを使用して、光学的に透明な(PMMAのような)立方体タンク(エッジ8 cm、面あたり厚さ2.8 mm)を設計します。 タンクの底部を中心とする円筒面(Ø=35mm)を挿入し、超音波探触子をモデル化する。 境界条件を、探触子表面での振幅1 μmの垂直変位で各壁の圧力を?…

Representative Results

時間安定で対称的に制御された非球面振動につながる気泡合体の完全なシーケンスを 図9に示します。2つの球状に振動する気泡の接近相は、2つの気泡の間の薄い液体膜が破裂したときに終了します。合体前の最後の段階で、バブル界面が球形度から逸脱することは注目に値します。両方の気泡は、接近の直線運動の経路に沿って楕円体形状に伸…

Discussion

提示された手順は、定常状態の対称制御された気泡形状振動をトリガーするために気泡合体を使用することで構成され、これらの振動によって引き起こされる長期的な流体の流れの研究を可能にします。この技術の主な課題は、境界から遠く離れた気泡が閉じ込められている場合の非球面振動の制御です。

文献で提案されている既存の技術のほとんどは、気泡中心の動?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、リヨン大学のLabEx CeLyA(ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007)の支援を受けました。

Materials

Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

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Cite This Article
Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

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