Summary

Analyse et spécification des distributions de taille granule d’amidon

Published: March 04, 2021
doi:

Summary

Présenté ici est une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative à deux paramètres. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granulés d’échantillons d’amidon à l’échelle graminale pour la recherche en sciences végétales et alimentaires.

Abstract

L’amidon de toutes les sources végétales est composé de granulés dans une gamme de tailles et de formes ayant des fréquences d’occurrence différentes, c’est-à-dire présentant une taille et une répartition desformes. Les données sur la taille des granules d’amidon déterminées à l’aide de plusieurs types de techniques de dimensionnement des particules sont souvent problématiques en raison d’une faible reproductibilité ou d’un manque de signification statistique résultant de certaines erreurs systématiques insurmontables, y compris la sensibilité aux formes granuleuses et aux limites des tailles des échantillons de granules. Nous avons décrit une procédure pour les déterminations reproductibles et statistiquement valides des distributions de taille granule d’amidon utilisant la technique de zone de détection électrique, et pour spécifier les distributions déterminées de taille lognormal de granule utilisant une forme multiplicative adoptée à deux paramètres avec une précision et une comparabilité améliorées. Il s’applique à toutes les analyses de dimensionnement granuleux d’échantillons d’amidon à l’échelle graminée et, par conséquent, pourrait faciliter les études sur la façon dont la taille des granules d’amidon est moulée par l’appareil et les mécanismes de biosynthèse de l’amidon; et comment ils ont un impact sur les propriétés et la fonctionnalité des amidons pour les utilisations alimentaires et industrielles. Les résultats représentatifs sont présentés à partir d’analyses de reproduction des distributions granulées d’échantillons d’amidon de la patate douce à l’aide de la procédure décrite. Nous avons en outre discuté de plusieurs aspects techniques clés de la procédure, en particulier, la spécification multiplicative des distributions de taille lognormal granule et certains moyens techniques pour surmonter le blocage fréquent de l’ouverture par granulés.

Introduction

Les granules d’amidon sont la structure physique dans laquelle deux polymères homoglucanes de réserve principaux dans les tissus de photosynthèse et de stockage des plantes, l’amylose linéaire ou peu ram ram ramée et l’amylopectine fortement ram ramée, sont emballés de façon ordonnée avec quelques composants mineurs, y compris les lipides et les protéines. Les granules d’amidon de diverses espèces végétales présentent de nombreuses formes tridimensionnelles (3D) (examinées en réf.1,2),y compris des sphères, des ellipsoides, des polyèdres, des plaquettes, des cubes, des cuboïdes et des tubules irréguliers. Même ceux du même tissu ou de tissus différents d’une même espèce végétale pourraient avoir un ensemble de formes avec des fréquences d’occurrence variables. En d’autres termes, les granules d’amidon d’une espèce végétale peuvent avoir une répartition statistique caractéristique de la forme, plutôt qu’une forme spécifique. Les formes granuleuses non uniformes et non sphériques rendent difficile la mesure et la définition adéquates de la taille des granules d’amidon. En outre, les granules d’amidon provenant des mêmes tissus d’une espèce végétale sont d’une gamme de tailles avec des proportions différentes, c’est-à-dire présentant une répartition caractéristique de la taille. Cette distribution de taille complique encore l’analyse et la description des tailles de granules d’amidon.

La taille des granules d’amidon a été analysée à l’aide de plusieurs catégories de techniques de dimensionnement des particules (examinées àl’réf. 3),y compris la microscopie, la sédimentation/fractionnement du débit de champ stérique (Sd/StFFF), la diffraction laser et la zone de détection électrique (ESZ). Cependant, ces techniques ne sont pas également adaptées à la détermination des tailles de granules d’amidon en présence d’une forme granule et d’une distribution de taille. La microscopie, y compris la microscopie électronique légère, confoccale et à balayage, est excellente pour les études de morphologie4,5,6,7, structure8,9 et développement10,11 de granules d’amidon, mais à peine adapté pour définir leurs distributions de taille en raison de certaines lacunes inhérentes. Les mesures directes d’images microscopiques de granules ou d’analyses d’images assistées par logiciel de données de microscopie optique (IAOM), qui ont été utilisées pour la détermination de la taille des granules d’amidons de plusieurs espèces, dontle maïs 12,le blé 13,le 14,la pomme de terre 15 et l’orge 16,ne peuvent mesurer que des images 1D (généralement de longueur maximale) ou 2D (surface) de nombres très limités (de dizaines à quelques milliers) d’images de granule d’amidon. Les petites tailles d’échantillonnage de granules qui sont intrinsèquement limitées par les techniques pourraient rarement être statistiquement représentatives, compte tenu des énormes nombres de granules par unité de poids de l’amidon (~120 x10 6 par gramme, en supposant que les sphères de 10 μm à 1,5 g/cm³ de densité) et, par conséquent, pourraient conduire à une mauvaise reproductibilité des résultats. La technique Sd/StFFF peut avoir une vitesse et une résolution élevées, et des fractions de taille étroite de granules d’amidon17, mais a été rarement utilisé probablement parce que sa précision pourrait être gravement affectée par des dommages, des formes différentes, et la densité des granules d’amidon. La technique de diffraction laser est la plus largement utilisée, et a été appliquée pour des analyses de taille granule d’amidon pour toutes les grandes espècesde cultures 3,14,16. Bien que la technique présente de nombreux avantages, elle n’est en fait pas adaptée à la détermination de la taille des granules d’amidon en présence d’une distribution de forme granulée. La plupart des instruments simultanés de diffraction laser s’appuient sur la théorie mie de diffusion de lalumière 18 pour les particules sphériques uniformes et sur la théorie modifiée de Mie18 pour d’autres formes d’uniformité. La technique est donc intrinsèquement très sensible aux formes de particules, et n’est pas tout à fait adaptée, même pour certaines formes d’uniformité19, et encore moins pour les granules d’amidon ayant un ensemble de formes de proportions différentes. La technique ESZ mesure la perturbation du champ électrique proportionnelle au volume de la particule passant par une ouverture. Il fournit des tailles de volume granulés, ainsi que les informations de distribution de nombre et de volume, etc., à haute résolution. Étant donné que la technique ESZ est indépendante des propriétés optiques des particules, y compris la couleur, la forme, la composition ou l’indice réfractif, et que les résultats sont très reproductibles, elle est particulièrement adaptée pour déterminer les distributions de taille des granules d’amidon ayant un ensemble de formes.

La taille des granules d’amidon a également été définie à l’aide de nombreux paramètres. Ils ont souvent été décrits de façon simpliste par diamètres moyens, qui dans certains cas étaient les moyens arithmétiques des longueurs maximales microscopiquement mesurées des images 2D12,20, ou moyennes de diamètres de sphère équivalents3. Dans d’autres cas, les distributions de la taille du granule ont été spécifiées en utilisant des plagesde taille 21,22, le volume moyen de distribution ou le diamètre moyen (équivalent sphère, pondéré par nombre, volume ou surface) en supposant une distribution normale14,23,24,25,26. Ces descripteurs de granules d’amidon provenant de diverses analyses sont d’une nature très différente, et pas strictement comparables. Il pourrait être très trompeur si ces « tailles » de granules d’amidon de différentes espèces ou même les mêmes tissus de la même espèce ont été directement comparés. De plus, le paramètre de propagation (ou de forme) des distributions normales présumées, c’est-à-dire l’écart type σ (ou écart type graphique σg)mesurant la largeur de la distribution (c.-à-d. la propagation des tailles), a été ignoré dans la plupart des études.

Afin de résoudre les problèmes critiques susmentionnés liés aux analyses de dimensionnement du granule d’amidon, nous avons décrit une procédure de détermination reproductible et statistiquement valide des distributions de granules des échantillons d’amidon à l’aide de la technique ESZ, et pour bien spécifier les distributions de taillenormales de granules déterminées à l’aide d’une forme multiplicative à deux paramètresadoptée 27 avec une précision et une comparabilité améliorées. Pour la validation et la démonstration, nous avons effectué des analyses de dimensionnement de granules de réplication d’échantillons d’amidon de sweetpotato à l’aide de la procédure, et spécifié les distributions différentielles lognormal volume-pourcentage volume-équivalent-sphère diamètre en utilisant leurs moyens Equation 1 géométriques graphiques et multiplicatifs écarts types s* dans Equation 1 un x/ (multiplier et diviser) s* forme.

Protocol

1. Préparation d’échantillons d’amidon Préparer deux (ou trois) échantillons d’amidon de reproduction à l’échelle du gramme provenant de tissus accumulant de l’amidon de diverses espèces végétales selon les procédures établies (p. ex., pommesde terre 15,patatesdouces 28,grainsde blé 13,29et grains demaïs 30,etc.). Lavez soigneusement les échantillon…

Representative Results

Pour valider la procédure, et démontrer la reproductibilité de la distribution déterminée de taille de granule, nous avons exécuté reproduire des analyses de dimensionnement des échantillons d’amidon de sweetpotato. Nous avons préparé des échantillons d’amidon de reproduction (S1 et S2) provenant de patates douces cultivées en champ d’une lignée de reproduction SC1149-19 à un âge de développement similaire à l’aide d’une procédureprécédemment décrite 28. De chaque ex…

Discussion

La procédure décrite a résolu certains problèmes critiques dans plusieurs méthodes existantes pour les analyses de la taille des granules d’amidon, y compris le dimensionnement 1D ou 2D inapproprié des granules 3D, la distorsion des mesures de dimensionnement en raison de formes granulés non uniformes, une faible reproductibilité et une validité statistique douteuse en raison de tailles limitées échantillon granuleux, spécification inexacte ou incorrecte (en particulier l’utilisation de la taille moyenne)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux sont en partie appuyés par le Cooperative Agriculture Research Center et le Integrated Food Security Research Center du College of Agriculture and Human Sciences de l’Université Prairie View A&M. Nous remercions Hua Tian pour son soutien technique.

Materials

Analytical beaker Beckman Coulter Life Sciences A35595 Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm Beckman Coulter Life Sciences A36394 For the MS4E, , 1000 µm
Disposable transfer pipettor, Fisher Scientific (Fishersci.com) 13-711-9AM Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml Fisher Scientific (Fishersci.com) 05-539-13 Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml Fisher Scientific (Fishersci.com) 02-540K These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs.
LiCl Fisher Chemical L121-100
Methanol Fisher Chemical A412-500 Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances Mettler Toledo 30243412 Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter Beckman Coulter Life Sciences B23005 The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H Hielscher Ultrasound Technology UP50H Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.

References

  1. Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D., BeMiller, J., Whistler, R. . Starch:Chemistry and Technology Food Science and Technology. , 23-82 (2009).
  2. Singh, N., Singh, J., Kaur, L., Singh Sodhi, N., Singh Gill, B. Morphological, thermal and rheological properties of starches from different botanical sources. Food Chemistry. 81 (2), 219-231 (2003).
  3. Lindeboom, N., Chang, P. R., Tyler, R. T. Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch – Stärke. 56 (34), 89-99 (2004).
  4. Baldwin, P. M., Davies, M. C., Melia, C. D. Starch granule surface imaging using low-voltage scanning electron microscopy and atomic force microscopy. International Journal of Biological Macromolecules. 21 (1-2), 103-107 (1997).
  5. Jane, J. L., Kasemsuwan, T., Leas, S., Zobel, H., Robyt, J. F. Anthology of starch granule morphology by scanning electron microscopy. Starch-Stärke. 46 (4), 121-129 (1994).
  6. Matsushima, R., Nakamura, Y. . Starch: Metabolism and Structure. , 425-441 (2015).
  7. Wang, S. -. q., Wanf, L. -. l., Fan, W. -. h., Cao, H., Cao, B. -. s. Morphological analysis of common edible starch granules by scanning electron microscopy. Food Science. 32 (15), 74-79 (2011).
  8. Baldwin, P. M., Adler, J., Davies, M. C., Melia, C. D. Holes in starch granules: confocal, SEM and light microscopy studies of starch granule structure. Starch-Stärke. 46 (9), 341-346 (1994).
  9. Chakraborty, I., Pallen, S., Shetty, Y., Roy, N., Mazumder, N. Advanced microscopy techniques for revealing molecular structure of starch granules. Biophysical Reviews. 12 (1), 105-122 (2020).
  10. Bechtel, D. B., Wilson, J. D. Amyloplast formation and starch granule development in hard red winter wheat. Cereal Chemistry. 80 (2), 175-183 (2003).
  11. Evers, A. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule development in the endosperm. Starch-Stärke. 23 (5), 157-162 (1971).
  12. Wang, Y. J., White, P., Pollak, L., Jane, J. L. Characterization of starch structures of 17 maize endosperm mutant genotypes with Oh43 inbred line background. Cereal Chemistry. 70, 171-179 (1993).
  13. Peng, M., Gao, M., Abdel-Aal, E. S. M., Hucl, P., Chibbar, R. N. Separation and characterization of A-and B-type starch granules in wheat endosperm. Cereal Chemistry. 76, 375-379 (1999).
  14. Wilson, J. D., Bechtel, D. B., Todd, T. C., Seib, P. A. Measurement of wheat starch granule size distribution using image analysis and laser diffraction technology. Cereal Chemistry. 83 (3), 259-268 (2006).
  15. Liu, Q., Weber, E., Currie, V., Yada, R. Physicochemical properties of starches during potato growth. Carbohydrate Polymers. 51 (2), 213-221 (2003).
  16. Chmelik, J., et al. Comparison of size characterization of barley starch granules determined by electron and optical microscopy, low angle laser light scattering and gravitational field-flow fractionation. Journal of the Institute of Brewing. 107 (1), 11-17 (2001).
  17. Moon, M. H., Giddings, J. C. Rapid separation and measurement of particle size distribution of starch granules by sedimentation/steric field-flow fractionation. Journal of Food Science. 58 (5), 1166-1171 (1993).
  18. Wriedt, T., Wolfram, H., Wriedt, T. . The Mie Theory: Basics and Applications. , 53-71 (2012).
  19. Schuerman, D. W., Wang, R. T., Gustafson, B. &. #. 1. 9. 7. ;. S., Schaefer, R. W. Systematic studies of light scattering. 1: Particle shape. Applied Optics. 20 (23), 4039-4050 (1981).
  20. Goering, K. J., Fritts, D. H., Eslick, R. F. A study of starch granule size and distribution in 29 barley varieties. Starch-Stärke. 25 (9), 297-302 (1973).
  21. Chen, Z., Schols, H. A., Voragen, A. G. J. Starch granule size strongly determines starch noodle processing and noodle quality. Journal of Food Sciences. 68 (5), 1584-1589 (2003).
  22. Dai, Z. M. Starch granule size distribution in grains at different positions on the spike of wheat (Triticum aestivum L.). Starch-Starke. 61 (10), 582-589 (2009).
  23. Edwards, M. A., Osborne, B. G., Henry, R. J. Effect of endosperm starch granule size distribution on milling yield in hard wheat. Journal of Cereal Science. 48 (1), 180-192 (2008).
  24. Karlsson, R., Olered, R., Eliasson, A. C. Changes in starch granule size distribution and starch gelatinization properties during development and maturation of wheat, barley and rye. Starch – Starke. 35 (10), 335-340 (1983).
  25. Li, W. -. Y., et al. Comparison of starch granule size distribution between hard and soft wheat cultivars in Eastern China. Agricultural Sciences China. 7 (8), 907-914 (2008).
  26. Park, S. H., Wilson, J. D., Seabourn, B. W. Starch granule size distribution of hard red winter and hard red spring wheat: Its effects on mixing and breadmaking quality. Journal of Cereal Science. 49 (1), 98-105 (2009).
  27. Limpert, E., Stahel, W. A., Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: keys and clues. Bioscience. 51 (5), 341-352 (2001).
  28. Gao, M., et al. Self-preserving lognormal volume-size distributions of starch granules in developing sweetpotatoes and modulation of their scale parameters by a starch synthase II (SSII). Acta Physiologiae Plantarum. 38 (11), 259 (2016).
  29. Wattebled, F., et al. STA11, a Chlamydomonas reinhardtii locus required for normal starch granule biogenesis, encodes disproportionating enzyme. Further evidence for a function of alpha-1,4 glucanotransferases during starch granule biosynthesis in green algae. Plant Physiology. 132 (1), 137-145 (2003).
  30. Ji, Y., Seetharaman, K., White, P. J. Optimizing a Small-Scale Corn-Starch Extraction Method for Use in the Laboratory. Cereal Chemistry. 81 (1), 55-58 (2004).
  31. Halloy, S., Whigham, P. The lognormal as universal descriptor of unconstrained complex systems: a unifying theory for complexity. Proceedings of the 7th Asia-Pacific Complex Systems Conference. , 309-320 (2004).
  32. Furusawa, C., Suzuki, T., Kashiwagi, A., Yomo, T., Kaneko, K. Ubiquity of log-normal distributions in intra-cellular reaction dynamics. Biophysics (Nagoya-shi). 1, 25-31 (2005).

Play Video

Cite This Article
Gao, M., Moussavi, M., Myers, D. Analysis and Specification of Starch Granule Size Distributions. J. Vis. Exp. (169), e61586, doi:10.3791/61586 (2021).

View Video