从Sézary综合征患者中分离人外周血单核细胞和CD4 + T细胞以进行转录组学分析

人类细胞具有潜在的传染性。因此，实验严格按照职业安全与健康管理局（OSHA）和个人防护设备（PPE）讨论的必要预防措施和程序进行。 1. 从全血中分离多溴联苯 从 表1 中收集所需的所有材料，并将它们带到室温（RT）。将RP10F加热至37°C。 将离心机调节至室温。除离心和细胞计数外，使用生物安全柜中的活细胞执行所有步骤。 在五个含有抗凝剂的10mL管（所需量）中获取血液。将全血储存在环境温度 （18\u201224 °C） 下。在 50 mL 分离管上标有待处理血液样本的人类研究受试者编号。 将 10\u201215 mL 血液输送到每个具有匹配受试者编号的分离管中。用汉克的平衡盐溶液（HBSS）稀释血液至少2倍。每根管不要超过35毫升稀释的血液。 小心地，慢慢地用〜13 mL密度培养基覆盖血液。观察管底部的透明密度介质，并在移液器几乎空时停止移液（以防止气泡释放）。小心取出移液器，以避免混合血液和密度介质层。 小心地将填充的分离管转移到离心机中，而不会干扰层。 在离心机制动器关闭的情况下以500× g 离心30分钟（减速设置为零）。注：如果离心机仅显示转速，请查阅转子规格以估算 500 x g 的转速当量。 小心地从离心机中取出分离管，而不会干扰层。观察在密度介质和等离子体层之间形成的黄褐色涂层。 从顶部移液以除去并丢弃大部分上部血浆部分，以便10 mL保留在buffy涂层上方。小心而缓慢地收集浅黄色的外套。将两个分离管中的buffy涂层转移到新的预标记和无菌的50mL管中，如图 1所示。 用HBSS稀释PBMC至少2倍，使每个新管中的体积达到50 mL。请记住将离心机制动器完全关闭。通过以400× g 离心10分钟沉淀PBMC。尽可能多地除去上清液，然后点击管的底部以松开沉淀。 为了裂解残留的红细胞 （RBC），每 10 mL 原始血容量将每个细胞沉淀重悬于 1\u20122 mL 氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液中。孵育5分钟。立即停止使用等体积或更大体积的 HBSS 裂解，并将体积调节至 50 mL。以400× g 离心10分钟。 取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。池化来自同一供体的细胞。使用 HBSS 使容量达到 50 mL。以400× g 离心10分钟。 取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。将细胞重悬于10mL温热的RP10F培养基中，并使用台盼蓝取等分试样进行活细胞计数。 使用血细胞计数器计算每个样品中的总细胞数。 2. 从多溴联苯中纯化CD4+CD45RO+T细胞 注意：从PBMCs中纯化CD4 + CD45RO + T细胞是通过使用市售的磁分离（参见 材料表）进行的，并进行微小的修改。最好按照试剂盒手册了解孵育时间，因为每个商业试剂盒都有自己的说明。 在10 mL选择缓冲液中洗涤所需量的PBMC。以400× g 离心10分钟。取出上清液并轻敲管底以松开沉淀。 在选择缓冲液中将PBMCs稀释至5 x 107 细胞/ mL，并将其转移到5 mL聚苯乙烯圆底管（12 x 75 mm）中。 每 1 mL 样品加入 50 μL 抗体混合物，轻轻混合。在室温下孵育5分钟。 使用前，立即以高速涡旋磁性颗粒30秒。将每1 mL样品中加入50μL磁性颗粒到含有PBMC的管中，并轻轻混合。 使用选择缓冲液将体积调至 2.5 mL，然后轻轻混合。将管（不带盖）放入磁铁中，并在室温下孵育2.5分钟。 拿起磁铁，在连续的运动中，反转磁铁和管子，将富集的细胞悬浮液倒入新的无菌管中。 为了增加恢复率，向留在磁体中的管中加入2.5 mL选择缓冲液，而不会干扰固定的磁珠。在磁铁中再保持2.5分钟，然后重复步骤2.6以恢复其他细胞。 服用等分试样，使用台盼蓝进行活细胞计数。使用血细胞计数器或细胞计数器计算总细胞数。 通过流式细胞术确认纯度（图3）。 3. 化学活化 用温热的RP10F培养基将CD4 + CD45RO + T细胞调节至5 x 106 细胞/ mL，并将细胞分配到所需大小的培养皿中。将细胞在加湿的37°C 5%CO2 培养箱中静置过夜。 通过以400× g 离心10分钟沉淀静置的细胞。取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。 用温热的 RP10F 培养基将细胞浓度调节至 5 x 106 个细胞/mL，并将 0.5\u20121 x 107 个细胞分布到三个无菌螺旋盖管中。注意：如果有足够的细胞可用，实验设计中可能包括重复的刺激或其他时间点。 用PMA和A23187刺激管2和3中的细胞。将 PMA 加入 25 ng/mL，将 A23187 加入 500 ng/mL，轻轻混合。向管1中的细胞中加入等体积的二甲基亚砜（DMSO），该管将用作载体（对照）。例如，如果使用1μLPMA和1μL A23187，则向车管中加入2μL DMSO。在所有试管中将DMSO的最终浓度保持在0.5%以下。 松开试管上的盖子，并将细胞返回到37°C 5%CO2 培养箱2小时（试管2）和6小时（试管1和3）。在指示的时间，以500× g 离心细胞10分钟。 在裂解之前，尽可能多地丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀。 按照市售RNA分离试剂盒的说明迅速裂解细胞（参见 材料表）。继续进行RNA分离，或在-80°C下冷冻裂解物，以便稍后使用其他样品进行处理。注意：RNA纯度和完整性可以使用微毛细管电泳进行验证。 可选：要从纯化的RNA样品中完全去除所有痕量DNA，请根据制造商的说明使用RNA纯化试剂盒（参见 材料表）。