Analyse av human naturlig killer celle metabolisme

Natural Killer (NK) celler er medfødte lymfocytter som medierer anti-tumor og anti-virale responser. NK-celler utgjør 5-15% av alle lymfocytter i humant perifert blod, og finnes også i milt, lever, benmarg og lymfeknuter. NK-celler uttrykker ikke polymorfe klnotypiske reseptorer, for eksempel T-cellereseptorer (TCR) eller B-cellereseptorer (BCR). I motsetning blir aktiveringen av deres cytolytiske funksjoner tilskyndet av engasjement av reseptorer som gjenkjenner uforanderlige ligandes på overflaten av en målcelle^1,2.

Hvile menneskelige NK celler isolert fra perifert blod kan overleve i flere dager i kultur medium supplert med menneskelig serum. Aktivering av NK-celler av cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellene til spredning og til en økning av deres drapsevne, blant annet^{effekter 3,4,5}. Flere studier har vist en direkte sammenheng mellom NK celleaktivering og endringer i deres metabolske^{aktivitet 6}. Disse metabolske endringene er bestemt til å møte de spesielle kravene til cellene når det gjelder energi og biosyntese.

Aerobe celler og organismer får energi gjennom en rekke kjemiske reaksjoner som involverer katabolisme og oksidasjon av karbohydrater, fett og proteiner. Gjennom en kombinasjon av glykose, tricarboxylic acid (TCA) syklus og oksidativ fosforylering, eukaryotiske celler oppfyller flertallet av deres ATP etterspørsel og få mellomprodukter som kreves som byggeklosser for makromolekyler avgjørende for cellevekst og spredning. Prosessen med glykose (figur 1A) starter med inntreden av glukose i cellen. I cytosolen er glukose fosforylert og forvandlet til pyruvat (med en nettoproduksjon av 2 molekyler av ATP per glukosemolekyl), som kan reduseres til laktat eller transporteres inn i mitokondriene for å bli forvandlet til Acetyl-CoA og gå inn i TCA-syklusen. TCA-syklusen fortsetter å sykle drevet med flere molekyler av Acetyl-CoA og produserer CO₂ (som til slutt vil spre seg utenfor cellen, og ved å reagere med H₂O i mediet, vil generere karbonsyre som vil føre til forsuring av mediet) og NADH, molekylet som har ansvaret for å donere elektroner til elektrontransportkjeden (ETC). Elektronene reiser gjennom forskjellige proteinkomplekser og blir endelig akseptert av oksygen. Disse kompleksene (I, III og IV) pumper også H^{+ fra} mitokondriematrisen inn i mellommembranerommet. Som en konsekvens av den elektrokjemiske gradienten som genereres, vil H⁺ gå inn igjen til matrisen gjennom den komplekse V (ATP-syntase), investere den potensielle energien akkumulert i generasjonen av ATP.

Både glykose og mitokondrie respirasjon kan blokkeres på forskjellige punkter ved hjelp av inhibitorer. Kunnskapen og bruken av disse hemmerne var grunnlaget for utviklingen av den ekstracellulære fluksanalysen. Ved å måle to enkle parametere i sanntid som pH og oksygen, utleder den ekstracellulære fluksaysatoren frekvensen av glykose og mitokondrieånding i en 96-brønns plate. Glykolysestresstesten utføres i et basalmedium uten glukose (figur 1B)⁷. De første målingene av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) indikerer glykolyse-uavhengig forsuring. Det kalles ikke-glykolytisk forsuring og korrelerer med CO₂ produsert av TCA som, som forklart tidligere, kombinerer med H₂O i mediet for å generere H⁺ (TCA-koblet ECAR). Den første injeksjonen er glukose for å indusere glukoseutnyttelse og øke glykose. Den andre injeksjonen kombinerer både rotenon, en kompleks I-hemmer, og antimycin A, en kompleks III-hemmer sammen, for å blokkere ETC. Cellene reagerer på denne dramatiske reduksjonen i mitokondrie-ATP-produksjon ved å aktivere glykose for å opprettholde cellulære ATP-nivåer, og dette representerer mengden glykose som ikke brukes av cellen i basaltilstanden, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel (kompenserende glykose). Den tredje injeksjonen er glukoseanalogen 2-Deoksygllukose (DG), som konkurrerer med glukose som substrat for enzymet hexokinase. Produktet av denne fosforyleringen, 2-deoksygllukose-6-fosfat kan ikke forvandles til pyruvat, og derfor er glykose blokkert, noe som senker ECAR til et minimum. ECAR målt på dette punktet inkluderer andre kilder til ekstracellulær forsuring som ikke tilskrives glykose eller respiratorisk aktivitet, samt eventuell gjenværende glykolyse som ikke er fullt hemmet av 2-DG (post 2-DG-forsuring).

Mitokondriestresstesten utføres i et medium med glukose (figur 1C)⁸. De første målingene av oksygenforbruket (OCR) tilsvarer basislinjen for mitokondrierespirasjon (basal respirasjon). Den første injeksjonen er oligomycin, som hemmer retur av protoner gjennom ATP-syntase (kompleks V), blokkerer ATP-syntese og dermed raskt hyperpolariserer mitokondriemembranen, noe som forhindrer ytterligere protonpumping gjennom respiratoriske komplekser, og fører til en reduksjon i OCR. Sammenligningen mellom baseline respirasjon og verdien gitt ved tilsetning av oligomycin representerer ATP-koblet åndedrett. Den gjenværende oligomycin-ufølsomme frekvensen av oksygenforbruk kalles protonlekkasje, som representerer strømmen av protoner gjennom lipid bilayer eller proteiner i den indre mitokondriemembranen som adeninkjernerotidtranslocase⁹. Den andre injeksjonen er den ukoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), en iionophore som induserer en massiv oppføring av H⁺ inn i mitokondriematrisen, noe som fører til depolarisering av mitokondriemembranen og forstyrrelse av mitokondrie-ATP-syntese. Celler reagerer på spredning av protonmotivkraften ved å øke frekvensen av elektrontransport og oksygenforbruk til maksimale nivåer i et nytteløst forsøk på å gjenopprette membranpotensialet (maksimal respiratorisk kapasitet). Forskjellen mellom maksimal respiratorisk kapasitet og basal respirasjon er cellens ekstra respiratoriske kapasitet, som representerer mengden åndedrett som ikke brukes av cellen til å generere ATP i basaltilstand, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel eller under forhold med stress⁸. Den tredje injeksjonen er en kombinasjon av rotenon og antimycin A. Denne injeksjonen stopper fullstendig ETC og OCR reduseres til sitt laveste nivå, med det gjenværende oksygenforbruket som ikke-mitokondrie (forårsaket av NADPH-oksidaser, etc.).

Endringer i metabolske veier kan liksom forutsi funksjonen av NK-celler, som det har blitt foreslått at kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro kan føre til NK celleutmattelse ved studiet av forskjellige metabolske veier^10,11. Sammenhengen mellom NK celle metabolsk status og funksjon er svært viktig fra synspunkt av kreft immunterapi. I dette feltet har aktivering av NK-celler med infusjon av IL-15, alene eller i kombinasjon med monoklonale terapeutiske antistoffer blitt testet for å forbedre tumorcelledrap^12,,13,,14. Kunnskapen om metabolsk status for NK-cellene som svar på disse behandlingsstrategiene ville gi en verdifull prediktor for NK celleaktiveringsstatus og drapsfunksjon.

Studien av metabolske veier i andre myeloide og lymfoide celler som monocytter, T og B celler har blitt beskrevet¹⁵ og optimaliserte metoder har blitt publisert¹⁶. I denne protokollen gir vi en metode som kombinerer både en NK-isolasjonsprotokoll som gir høyt antall rene og levedyktige NK-celler og en optimalisert protokoll for å måle metabolsk aktivitet ved hjelp av en ekstracellulær fluksaysator. Her viser vi at dette er en gyldig metode for studiet av metabolske endringer i hvile og IL-15 aktiverte menneskelige NK-celler. For den ekstracellulære fluksanalysen har parametere som cellenummer og legemiddelkonsentrasjoner blitt testet og optimalisert. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, er den ekstracellulære fluksalysatoren helautomatisk og i stand til å teste i sanntid, med svært lave mengder celler, opptil 92 prøver samtidig, og tillater dermed høy gjennomstrømning screenings (med flere prøver og replikerer) på en relativt rask^{måte 17}.

Denne metoden kan brukes av forskere som er interessert i å vurdere NK cellefunksjon ved å studere NK cellemetabolisme. Det kan brukes også på celler aktivert av andre cytokiner, antistoffer eller løselige stimuli.