I dette papiret beskriver vi en metode for å måle glykose og mitokondriegånding i primære humane Natural Killer (NK) celler isolert fra perifert blod, i ro eller etter IL15-indusert aktivering. Protokollen som beskrives kan lett utvides til primære menneskelige NK-celler aktivert av andre cytokiner eller løselige stimuli.
Natural Killer (NK) celler medierer hovedsakelig medfødte anti-tumor og anti-viral immunrespons og reagerer på en rekke cytokiner og andre stimuli for å fremme overlevelse, cellulær spredning, produksjon av cytokiner som interferon gamma (IFNγ) og / eller cytotoksisitetsprogrammer. NK celle aktivering av cytokin stimulering krever en betydelig ombygging av metabolske veier for å støtte deres bioenergetiske og biosyntetiske krav. Det er en stor mengde bevis som tyder på at nedsatt NK celle metabolisme er forbundet med en rekke kroniske sykdommer, inkludert fedme og kreft, som fremhever den kliniske betydningen av tilgjengeligheten av en metode for å bestemme NK celle metabolisme. Her beskriver vi bruken av en ekstracellulær fluksaysator, en plattform som tillater sanntidsmålinger av glykose og mitokondrieoksygenforbruk, som et verktøy for å overvåke endringer i energimetabolismen til menneskelige NK-celler. Metoden som er beskrevet her, gjør det også mulig å overvåke metabolske endringer etter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, et system som for tiden undersøkes i et bredt spekter av kliniske studier.
Natural Killer (NK) celler er medfødte lymfocytter som medierer anti-tumor og anti-virale responser. NK-celler utgjør 5-15% av alle lymfocytter i humant perifert blod, og finnes også i milt, lever, benmarg og lymfeknuter. NK-celler uttrykker ikke polymorfe klnotypiske reseptorer, for eksempel T-cellereseptorer (TCR) eller B-cellereseptorer (BCR). I motsetning blir aktiveringen av deres cytolytiske funksjoner tilskyndet av engasjement av reseptorer som gjenkjenner uforanderlige ligandes på overflaten av en målcelle1,2.
Hvile menneskelige NK celler isolert fra perifert blod kan overleve i flere dager i kultur medium supplert med menneskelig serum. Aktivering av NK-celler av cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellene til spredning og til en økning av deres drapsevne, blant anneteffekter 3,4,5. Flere studier har vist en direkte sammenheng mellom NK celleaktivering og endringer i deres metabolskeaktivitet 6. Disse metabolske endringene er bestemt til å møte de spesielle kravene til cellene når det gjelder energi og biosyntese.
Aerobe celler og organismer får energi gjennom en rekke kjemiske reaksjoner som involverer katabolisme og oksidasjon av karbohydrater, fett og proteiner. Gjennom en kombinasjon av glykose, tricarboxylic acid (TCA) syklus og oksidativ fosforylering, eukaryotiske celler oppfyller flertallet av deres ATP etterspørsel og få mellomprodukter som kreves som byggeklosser for makromolekyler avgjørende for cellevekst og spredning. Prosessen med glykose (figur 1A) starter med inntreden av glukose i cellen. I cytosolen er glukose fosforylert og forvandlet til pyruvat (med en nettoproduksjon av 2 molekyler av ATP per glukosemolekyl), som kan reduseres til laktat eller transporteres inn i mitokondriene for å bli forvandlet til Acetyl-CoA og gå inn i TCA-syklusen. TCA-syklusen fortsetter å sykle drevet med flere molekyler av Acetyl-CoA og produserer CO2 (som til slutt vil spre seg utenfor cellen, og ved å reagere med H2O i mediet, vil generere karbonsyre som vil føre til forsuring av mediet) og NADH, molekylet som har ansvaret for å donere elektroner til elektrontransportkjeden (ETC). Elektronene reiser gjennom forskjellige proteinkomplekser og blir endelig akseptert av oksygen. Disse kompleksene (I, III og IV) pumper også H+ fra mitokondriematrisen inn i mellommembranerommet. Som en konsekvens av den elektrokjemiske gradienten som genereres, vil H+ gå inn igjen til matrisen gjennom den komplekse V (ATP-syntase), investere den potensielle energien akkumulert i generasjonen av ATP.
Både glykose og mitokondrie respirasjon kan blokkeres på forskjellige punkter ved hjelp av inhibitorer. Kunnskapen og bruken av disse hemmerne var grunnlaget for utviklingen av den ekstracellulære fluksanalysen. Ved å måle to enkle parametere i sanntid som pH og oksygen, utleder den ekstracellulære fluksaysatoren frekvensen av glykose og mitokondrieånding i en 96-brønns plate. Glykolysestresstesten utføres i et basalmedium uten glukose (figur 1B)7. De første målingene av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) indikerer glykolyse-uavhengig forsuring. Det kalles ikke-glykolytisk forsuring og korrelerer med CO2 produsert av TCA som, som forklart tidligere, kombinerer med H2O i mediet for å generere H+ (TCA-koblet ECAR). Den første injeksjonen er glukose for å indusere glukoseutnyttelse og øke glykose. Den andre injeksjonen kombinerer både rotenon, en kompleks I-hemmer, og antimycin A, en kompleks III-hemmer sammen, for å blokkere ETC. Cellene reagerer på denne dramatiske reduksjonen i mitokondrie-ATP-produksjon ved å aktivere glykose for å opprettholde cellulære ATP-nivåer, og dette representerer mengden glykose som ikke brukes av cellen i basaltilstanden, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel (kompenserende glykose). Den tredje injeksjonen er glukoseanalogen 2-Deoksygllukose (DG), som konkurrerer med glukose som substrat for enzymet hexokinase. Produktet av denne fosforyleringen, 2-deoksygllukose-6-fosfat kan ikke forvandles til pyruvat, og derfor er glykose blokkert, noe som senker ECAR til et minimum. ECAR målt på dette punktet inkluderer andre kilder til ekstracellulær forsuring som ikke tilskrives glykose eller respiratorisk aktivitet, samt eventuell gjenværende glykolyse som ikke er fullt hemmet av 2-DG (post 2-DG-forsuring).
Mitokondriestresstesten utføres i et medium med glukose (figur 1C)8. De første målingene av oksygenforbruket (OCR) tilsvarer basislinjen for mitokondrierespirasjon (basal respirasjon). Den første injeksjonen er oligomycin, som hemmer retur av protoner gjennom ATP-syntase (kompleks V), blokkerer ATP-syntese og dermed raskt hyperpolariserer mitokondriemembranen, noe som forhindrer ytterligere protonpumping gjennom respiratoriske komplekser, og fører til en reduksjon i OCR. Sammenligningen mellom baseline respirasjon og verdien gitt ved tilsetning av oligomycin representerer ATP-koblet åndedrett. Den gjenværende oligomycin-ufølsomme frekvensen av oksygenforbruk kalles protonlekkasje, som representerer strømmen av protoner gjennom lipid bilayer eller proteiner i den indre mitokondriemembranen som adeninkjernerotidtranslocase9. Den andre injeksjonen er den ukoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), en iionophore som induserer en massiv oppføring av H+ inn i mitokondriematrisen, noe som fører til depolarisering av mitokondriemembranen og forstyrrelse av mitokondrie-ATP-syntese. Celler reagerer på spredning av protonmotivkraften ved å øke frekvensen av elektrontransport og oksygenforbruk til maksimale nivåer i et nytteløst forsøk på å gjenopprette membranpotensialet (maksimal respiratorisk kapasitet). Forskjellen mellom maksimal respiratorisk kapasitet og basal respirasjon er cellens ekstra respiratoriske kapasitet, som representerer mengden åndedrett som ikke brukes av cellen til å generere ATP i basaltilstand, men kan potensielt rekrutteres som svar på økninger i ATP-etterspørsel eller under forhold med stress8. Den tredje injeksjonen er en kombinasjon av rotenon og antimycin A. Denne injeksjonen stopper fullstendig ETC og OCR reduseres til sitt laveste nivå, med det gjenværende oksygenforbruket som ikke-mitokondrie (forårsaket av NADPH-oksidaser, etc.).
Endringer i metabolske veier kan liksom forutsi funksjonen av NK-celler, som det har blitt foreslått at kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro kan føre til NK celleutmattelse ved studiet av forskjellige metabolske veier10,11. Sammenhengen mellom NK celle metabolsk status og funksjon er svært viktig fra synspunkt av kreft immunterapi. I dette feltet har aktivering av NK-celler med infusjon av IL-15, alene eller i kombinasjon med monoklonale terapeutiske antistoffer blitt testet for å forbedre tumorcelledrap12,,13,,14. Kunnskapen om metabolsk status for NK-cellene som svar på disse behandlingsstrategiene ville gi en verdifull prediktor for NK celleaktiveringsstatus og drapsfunksjon.
Studien av metabolske veier i andre myeloide og lymfoide celler som monocytter, T og B celler har blitt beskrevet15 og optimaliserte metoder har blitt publisert16. I denne protokollen gir vi en metode som kombinerer både en NK-isolasjonsprotokoll som gir høyt antall rene og levedyktige NK-celler og en optimalisert protokoll for å måle metabolsk aktivitet ved hjelp av en ekstracellulær fluksaysator. Her viser vi at dette er en gyldig metode for studiet av metabolske endringer i hvile og IL-15 aktiverte menneskelige NK-celler. For den ekstracellulære fluksanalysen har parametere som cellenummer og legemiddelkonsentrasjoner blitt testet og optimalisert. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, er den ekstracellulære fluksalysatoren helautomatisk og i stand til å teste i sanntid, med svært lave mengder celler, opptil 92 prøver samtidig, og tillater dermed høy gjennomstrømning screenings (med flere prøver og replikerer) på en relativt raskmåte 17.
Denne metoden kan brukes av forskere som er interessert i å vurdere NK cellefunksjon ved å studere NK cellemetabolisme. Det kan brukes også på celler aktivert av andre cytokiner, antistoffer eller løselige stimuli.
I dette papiret har vi etablert en protokoll for effektivt å isolere og kultivere rene og levedyktige primære menneskelige NK-celler fra perifert blod. Vi har også optimalisert betingelsene for måling av metabolsk aktivitet av disse NK-cellene vurdert av oksygenforbruk og ekstracellulær forsuring ved hjelp av en ekstracellulær fluksasanalysator. Sammenlignet med andre respirometriske metoder er den ekstracellulære fluksalysatoren rask, krever et lite antall celler og tillater screeninger med høy gjennomstrømming…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for støtte og diskusjon. Denne studien ble støttet av Intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute og National Heart, Lung, and Blood Institute. JT støttes av Ramon y Cajal-programmet (stipend RYC2018-026050-I) av MICINN (Spania).
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |