인간 자연 킬러 세포 대사의 분석
Summary
본 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 분리된 1 차적인 인간 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡을 측정하는 방법을 기술합니다, 휴식 또는 IL15 유도된 활성화에 따라. 설명된 프로토콜은 다른 사이토카인 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 1차 인간 NK 세포로 쉽게 확장될 수 있었다.
Abstract
천연 킬러(NK) 세포는 주로 선천적 항종양 및 항바이러스 면역 반응을 중재하고 다양한 사이토카인 및 기타 자극에 반응하여 생존, 세포 증식, 인터페론 감마(IFNγ) 및/또는 세포 독성 프로그램과 같은 사이토카인의 생산을 촉진한다. 사이토카인 자극에 의한 NK 세포 활성화는 그들의 생에너지 및 생합성 요구 사항을 지원하기 위하여 신진 대사 통로의 실질적인 리모델링을 요구합니다. NK 세포 대사가 손상되면 NK 세포 대사를 결정하는 방법의 가용성의 임상 적 중요성을 강조하는 비만 및 암을 포함한 다수의 만성 질환과 관련이 있음을 시사하는 증거가 많이 있습니다. 여기서 우리는 인간 NK 세포의 에너지 대사의 변화를 모니터링하는 도구로, 글리코리시스와 미토콘드리아 산소 소비의 실시간 측정을 허용하는 플랫폼인 세포외 플럭스 분석기의 사용을 설명합니다. 여기에 설명된 방법은 또한 IL-15와 같은 사이토카인을 가진 NK 세포의 자극 후 대사 변화를 모니터링할 수 있게 해주며, 현재 광범위한 임상 시험에서 조사되고 있는 시스템이다.
Introduction
천연 킬러 (NK) 세포는 항 종양 및 항 바이러스 반응을 중재하는 선천성 림프구입니다. NK 세포는 인간 말초 혈액에 있는 모든 림프구의 5-15%를 포함하고, 또한 비장, 간, 골수 및 림프절에서 찾아볼 수 있습니다. NK 세포는 T 세포 수용체(TCR) 또는 B-세포 수용체(BCR)와 같은 다형성 클로노티픽 수용체를 발현하지 않는다. 대조적으로, 그들의 세포분석 기능의 활성화는 표적 세포1의표면에 불변의 리간드를 인식하는 수용체의 참여에 의해 자극된다1,2.
말초 혈액에서 분리 된 인간의 NK 세포를 휴식 인간 혈 청으로 보충 하는 배양 배지에서 며칠 동안 살아남을 수 있습니다. IL-15 또는 IL-2와 같은 사이토카인에 의한 NK 세포의 활성화는 세포를 증식하고 그들의 살상 능력의 증가로 유도하며, 다른 효과 들사이에서3,,4,,5. 몇몇 연구 결과는 그들의 신진 대사 활동에 있는 NK 세포 활성화 그리고 변경 사이 직접적인 상관관계를 보여주었습니다6. 이러한 신진 대사 변화는 에너지와 생합성의 관점에서 세포의 특정 요구 사항을 충족 하도록 운명.
호기성 세포와 유기체는 탄수화물, 지방 및 단백질의 이화작용 및 산화를 수반하는 일련의 화학 반응을 통해 에너지를 얻습니다. 글리코리시스, 트리카박실산(TCA) 주기 및 산화 인산화의 조합을 통해, 진핵세포는 ATP 수요의 대부분을 충족하고 세포 성장 및 증식에 필수적인 거대 분자를 위한 빌딩 블록으로 요구되는 중간체를 얻습니다. 글리코리시스(도1A)의공정은 세포내 포도당의 진입로 시작한다. 시토솔에서 포도당은 인산화되어 피루바테(포도당 분자당 ATP 분자 2분자의 순 생산)로 변형되어 젖산으로 감소하거나 미토콘드리아로 이송하여 아세틸-코아로 변형하여 TCA 주기를 입력합니다. TCA 주기는 아세틸-CoA의 더 많은 분자로 연료를 공급하고 CO2를 생성합니다 (결국 세포 외부에서 확산되고, 매체에서 H2O와 반응함으로써, 매체의 산성화로 이어질 탄산산을 생성합니다) 및 NADH, 전자 수송 체인 (ETC)에 전자를 기증하는 분자. 전자는 다른 단백질 복합체를 통해 여행하고 마지막으로 산소에 의해 허용됩니다. 이러한 복합체(I, III 및 IV)는 미토콘드리아 매트릭스에서 막 간 공간으로 H+를 펌핑합니다. 생성된 전기화학적 그라데이션의 결과로 H+는 복잡한 V(ATP-synthase)를 통해 매트릭스에 다시 입력하여 ATP 생성에 축적된 잠재적 에너지를 투자합니다.
글리코리시스와 미토콘드리아 호흡은 억제제를 사용하여 다른 지점에서 차단될 수 있다. 이러한 억제제의 지식과 사용은 세포외 플럭스 분석의 개발을 위한 기초였다. pH 및 산소와 같은 두 가지 간단한 파라미터를 실시간으로 측정함으로써 세포외 플럭스 분석기는 96웰 플레이트에서 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡의 속도를 유추합니다. 글리코리시스 스트레스 시험은 포도당 없이 기저 배지에서 수행된다(도1B)7. 세포외 산성화속도(ECAR)의 첫 번째 측정은 글리코리시스 독립적인 산성화를 나타낸다. 이전에 설명한 바와 같이 배지에서 H2 O와 결합하여 H +(TCA-연결된 ECAR)를 생성하는 TCA에 의해+ 생성된 CO2와 비혈당산성화라고 합니다.2 첫 번째 주사는 포도당 활용을 유도 하 고 글리코 리 시 증을 향상 하는 포도 당이다. 두 번째 주사는 두 로테네톤을 결합, 복합 I 억제제, 및 항마이신 A, 복합 III 억제제, ETC. 세포가 세포 ATP 수준을 유지하기 위해 글리코분해를 활성화하여 미토콘드리아 ATP 생산의 이러한 극적인 감소에 반응하는 것을 차단하고, 이는 기저 상태의 세포에 의해 사용되지 않지만 ATP 수요증가에 대응하여 잠재적으로 모집될 수 있는 글리코리시스의 양을 나타낸다. 세 번째 주사는 포도당 아날로그 2-Deoxyglucose (DG), 효소 헥소키나아제에 대 한 기판으로 포도당과 경쟁. 이 인산화의 생성물, 2-deoxyglucose-6-인산염은 피루바테로 변환될 수 없고, 따라서 글리코리시스가 막혀 ECAR를 최소한으로 낮춥습니다. 이 시점에서 측정된 ECAR에는 글리코리시스 또는 호흡기 활성뿐만 아니라 2-DG(Post 2-DG 산성화)에 의해 완전히 억제되지 않은 잔류 당화에 기인하지 않는 세포외 산성화의 다른 공급원을 포함한다.
미토콘드리아 스트레스 시험은 포도당(도1C)8을가진 배지에서 수행됩니다. 산소 소비속도(OCR)의 첫 번째 측정은 미토콘드리아 호흡(기저 호흡)의 기저선에 대응한다. 첫 번째 주사는 ATP 신타제(복합 V)를 통해 양성자의 반환을 억제하는 올리고마이신으로, ATP 합성을 차단하여 미토콘드리아 멤브레인을 급속히 극화하여 호흡기 복합체를 통해 추가 양성자가 펌핑되는 것을 방지하고 OCR의 감소로 이어집니다. 기준선 호흡과 올리고마이신을 첨가하여 주어진 값 간의 비교는 ATP 연결 호흡을 나타낸다. 산소 소비의 나머지 올리고마이신 무감각 비율은 양성자 누출이라고 하며, 이는 아데닌 뉴클레오티드 트랜스로케이스9와같은 내부 미토콘드리아 막내지질 이중층 또는 단백질을 통한 양성자의 흐름을 나타낸다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 막의 탈극화및 미토콘드리아 ATP 합성의 중단으로 이어지는 미토콘드리아 매트릭스에 H+의 대규모 진입을 유도하는 비커플러 2,4-디니트로페놀(DNP)이다. 세포는 막 전위(최대 호흡 용량)를 복구하려는 쓸데없는 시도에서 전자 수송 및 산소 소비 속도를 최대 수준으로 증가시킴으로써 양성자 동기력의 소멸에 반응한다. 최대 호흡 용량과 기저 호흡의 차이는 세포의 예비 호흡 용량으로, 이는 세포가 기저 상태에서 ATP를 생성하는 데 사용되지 않는 호흡의 양을 나타내지만 ATP 수요의 증가 또는 스트레스8의조건 하에서 잠재적으로 모집 될 수 있다. 세 번째 주사는 로테네온과 항마이신 A의 조합이다. 이 주사는 ETC와 OCR이 가장 낮은 수준으로 감소하는 것을 완전히 막고, 나머지 산소 소비는 비 미토콘드리아 (NADPH-산화제 등에 의한)입니다.
대사 경로의 변화는 체외에서 사이토카인을 가진 NK 세포의 지속적인 활성화가 다른 대사 경로10,,11의연구에 의해 NK 세포 피로로 이어질 수 있음을 시사했기 때문에 어떻게 든 NK 세포의 기능을 예측할 수 있었다. NK 세포 대사 상태와 기능 사이의 상관 관계는 암 면역 요법의 관점에서 매우 중요하다. 본 분야에서, IL-15의 주입을 갖는 NK 세포의 활성화, 단독으로 또는 단일 클론 치료 항체와 병용하여 종양 세포 살해를 개선하기 위해 시험되었다12,,13,,14. 이러한 치료 전략에 대한 응답으로 NK 세포의 대사 상태에 대한 지식은 NK 세포 활성화 상태 및 살인 기능의 귀중한 예측을 제공 할 것입니다.
단핵구, T 및 B 세포와 같은 다른 골수성 및 림프구 세포에서 대사 경로에 대한 연구는15에 설명되고 최적화된 방법이16에발표되었다. 이 프로토콜에서 우리는 순수하고 실행 가능한 NK 세포의 높은 숫자를 산출하는 NK 절연 프로토콜과 세포 외 플럭스 분석기를 사용하여 대사 활동을 측정하는 최적화 된 프로토콜을 모두 결합하는 방법을 제공합니다. 여기서 우리는 이것이 휴식과 IL-15 활성화 된 인간 NK 세포에 있는 신진 대사 변경의 연구를 위한 유효한 방법임을 보여줍니다. 세포 외 플럭스 분석의 경우 세포 수 및 약물 농도와 같은 매개 변수가 테스트되고 최적화되었습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 완전히 자동화되어 매우 적은 양의 세포, 최대 92 개의 샘플을 동시에 테스트 할 수 있으므로 비교적 빠른 방식으로 높은 처리량 스크리닝 (여러 샘플 및 복제)을 허용합니다17.
이 방법은 NK 세포 대사를 공부하여 NK 세포 기능을 평가하는 데 관심이있는 연구원에 의해 사용될 수 있습니다. 그것은 그밖 사이토카인, 항체 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 세포에 또한 적용될 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 순수하고 실행 가능한 1 차적인 인간 NK 세포를 효율적으로 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설립했습니다. 우리는 또한 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 산소 소비율 및 세포외 산성화 율에 의해 평가된 이들 NK 세포의 대사 활성 측정을 위한 조건을 최적화했습니다. 다른 호흡 측정 방법에 비해 세포 외 플럭스 분석기는 빠르며 소수의 세포가 필요하며 높?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 마이클 N. 삭 박사(국립 심장, 폐 및 혈액 연구소)에게 지원과 토론을 해 주셔서 감사합니다. 이 연구는 건강의 국가 학회, 국립 암 연구소 및 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. JT는 미킨(스페인)의 라몬 이 카잘 프로그램(교부라이C2018-026050-I)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
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