Summary

ניתוח של חילוף החומרים של תאי הרוצח הטבעי האנושי

Published: June 22, 2020
doi:

Summary

במאמר זה, אנו מתארים שיטה למדוד גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלי בתאים קטלניים אנושיים עיקריים (NK) מבודדים מדם היקפי, במנוחה או בעקבות הפעלה המושרה IL15. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מורחב בקלות לתאי NK אנושיים ראשוניים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים או גירויים מסיסים.

Abstract

תאי רוצח טבעי (NK) לתווך בעיקר תגובות אנטי-סרטיות ואנטי-ויראליות מולדות חיסוניות ומגיבים למגוון רחב של ציטוקינות וגירויים אחרים כדי לקדם הישרדות, התפשטות תאית, ייצור ציטוקינות כגון אינטרפרון גמא (IFNơ) ו / או תוכניות cytotoxicity. הפעלת תא NK על ידי גירוי ציטוקין דורש שיפוץ משמעותי של מסלולים מטבוליים כדי לתמוך בדרישות ביו-אנראזטיות וביו-סינתטיות שלהם. יש גוף גדול של ראיות המצביעות על כך חילוף חומרים לקוי של תאים NK קשורה מספר מחלות כרוניות כולל השמנת יתר וסרטן, אשר מדגיש את החשיבות הקלינית של הזמינות של שיטה כדי לקבוע את חילוף החומרים של תאים NK. כאן אנו מתארים את השימוש במנתח שטף חוץ-תאי, פלטפורמה המאפשרת מדידות בזמן אמת של גליקוליזה וצריכת חמצן מיטוכונדריאלי, ככלי לניטור שינויים בחילוף החומרים של האנרגיה של תאי NK אנושיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת גם ניטור של שינויים מטבוליים לאחר גירוי של תאי NK עם ציטוקינות כגון IL-15, מערכת כי הוא נחקר כעת במגוון רחב של ניסויים קליניים.

Introduction

תאי רוצח טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים לתווך תגובות אנטי-סרטני ואנטי ויראלי. תאי NK מהווים 5-15% מכל הלימפוציטים בדם היקפי אנושי, וניתן למצוא אותם גם בטחול, כבד, מח עצם ובלוטות לימפה. תאי NK אינם מבטאים קולטנים קלונוטיפים פולימורפיים, כגון קולטני תאי T (TCR) או קולטני תאי B (BCR). לעומת זאת, ההפעלה של פונקציות cytolytic שלהם מתבקש על ידי המעורבות של קולטנים המזהים ליגנדים שונים על פני השטח של תא היעד1,,2.

מנוחה תאי NK אנושיים מבודדים מדם היקפי יכול לשרוד במשך כמה ימים במדיום תרבות בתוספת נסיוב אנושי. הפעלה של תאי NK על ידי ציטוקינות כגון IL-15 או IL-2 מניעה את התאים להתפשטות ולעלייה ביכולת ההרג שלהם, בין היתר3,,4,,5. מספר מחקרים הראו מתאם ישיר בין הפעלת תא NK ושינויים בפעילות חילוף החומרים שלהם6. שינויים מטבוליים אלה נועדו לענות על הדרישות הספציפיות של התאים במונחים של אנרגיה וביוסינתזה.

תאים אירוביים ואורגניזמים להשיג אנרגיה באמצעות סדרה של תגובות כימיות המערבות את הקטבוליזם וחמצון של פחמימות, שומן וחלבונים. באמצעות שילוב של גליקוליזה, מחזור חומצה tricarboxylic (TCA) וphosphorylation חמצוני, תאים אאוקריוטיים לענות על רוב הביקוש ATP שלהם ולקבל ביניים הנדרשים אבני בניין עבור מקרומולקולות חיוני לצמיחת תאים והתפשטות. תהליך הגליקוליזה(איור 1A)מתחיל בכניסה של גלוקוז בתא. בציטוסול, גלוקוז הוא זרחן והפך pyruvate (עם ייצור נטו של 2 מולקולות של ATP לכל מולקולת גלוקוז), אשר ניתן להפחית ללקטאט או מועבר לתוך המיטוכונדריה כדי להפוך אצטיל-CoA ולהיכנס מחזור TCA. מחזור TCA ממשיך רכיבה על אופניים מתודלק עם מולקולות יותר של אצטיל-CoA ומייצר CO 2 (כי בסופו של דבריהיה לפזר מחוץ לתא, על ידי תגובה עם H2O במדיום, ייצור חומצה פחמתית תוביל חומציות של המדיום) ו NADH, המולקולה האחראית על תרומת אלקטרונים לשרשרת תחבורת אלקטרונים (ETC). האלקטרונים נעים דרך מתחמי חלבון שונים ולבסוף מתקבלים על ידי חמצן. מתחמים אלה (I, III ו- IV) גם לשאוב H+ מ מטריצה מיטוכונדריאלי לחלל intermembrane. כתוצאה מההדרגה האלקטרוכימית שנוצרה, ה-H+ ייכנס שוב למטריצה דרך V המורכב (ATP-סינתאז), וישקיע את האנרגיה הפוטנציאלית שנצברה בדור ה-ATP.

הן גליקוליזה והן הנשימה המיטוכונדריאלית ניתן לחסום בנקודות שונות באמצעות מעכבים. הידע והשימוש של מעכבים אלה היה הבסיס להתפתחות של תסיסה שטף חוץ תאי. על ידי מדידת שני פרמטרים פשוטים בזמן אמת כגון pH וחמצן, מנתח השטף החוץ-תאי משער את קצב גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית בצלחת 96-באר. בדיקת הלחץ גליקוליזה מבוצעת במדיום בסיס ללא גלוקוז (איור 1B)7. המדידות הראשונות של קצב החומציות החוץ-תאי (ECAR) מצביעות על חומציות עצמאית-גליקוליזה. הוא מכונה חומציות שאינה גליקולית ומתאים עם CO2 המיוצר על ידי TCA אשר, כפי שהוסבר קודם לכן, משתלב עם H2O במדיום כדי ליצור H+ (TCA מקושר ECAR). הזריקה הראשונה היא גלוקוז כדי לגרום לניצול גלוקוז ולהגביר את הגליקווליזה. הזריקה השנייה משלבת את שניהם רוטנון, מעכב מורכב אני, ואנטימיצין A, מעכב III מורכב יחד, כדי לחסום את התאים ETC. להגיב לירידה דרמטית זו בייצור ATP מיטוכונדריאלי על ידי הפעלת גליקוליזה כדי לשמור על רמות ATP הסלולר, וזה מייצג את כמות גליקוליזה כי אינו בשימוש על ידי התא במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס פוטנציאלי בתגובה לעליות בביקוש ATP (גליקוזיס מפצה). הזריקה השלישית היא הגלוקוז אנלוגי 2-Deoxyglucose (DG), אשר מתחרה עם גלוקוז כצע לאנזים hexokinase. המוצר של פוספורילציה זו, 2-deoxyglucose-6-פוספט לא ניתן להפוך pyruvate, ולכן גליקוליזה חסומה, אשר מוריד את ECAR למינימום שלה. ECAR נמדד בשלב זה כולל מקורות אחרים של חומציות חוץ תאית כי אינם מיוחסים גליקוליזה או פעילות נשימתית, כמו גם כל גליקוליזה שיורית לא מעוכב באופן מלא על ידי 2-DG (פוסט 2-DG-חומציות).

בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי מבוצעת במדיום עם גלוקוז(איור 1C)8. המדידות הראשונות של קצב צריכת החמצן (OCR) תואמות לקו הבסיס של הנשימה המיטוכונדריאלית (הנשימה הבסיסית). הזריקה הראשונה היא oligomycin, אשר מעכב את חזרתם של פרוטונים דרך סינתאז ATP (V מורכב), חסימת סינתזה ATP ובכך במהירות hyperpolarize קרום המיטוכונדריה, אשר מונע פרוטון נוסף שאיבה דרך מתחמי נשימה, ומוביל לירידה OCR. ההשוואה בין הנשימה הבסיסית לבין הערך שניתן על-ידי הוספת אוליגומיצין מייצגת את הנשימה המקושרת ל-ATP. שאר oligomycin-קצב רגיש של צריכת חמצן נקרא דליפת פרוטון, אשר מייצג את זרימת פרוטונים דרך דוטל השימנים או חלבונים קרום המיטוכונדריה הפנימית כגון טרנסלוקאז נוקלאוטיד אדנין9. הזריקה השנייה היא uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), יונופור שגורם כניסה מסיבית של H+ לתוך מטריצת המיטוכונדריה, אשר מוביל depolarization של קרום המיטוכונדריה ושיבוש של סינתזה ATP מיטוכונדריאלי. תאים מגיבים לפיזה של כוח מניע פרוטון על ידי הגדלת קצב תחבורת אלקטרונים וצריכת חמצן לרמות מרביות בניסיון חסר תועלת לשחזר את פוטנציאל קרום (קיבולת נשימתית מקסימלית). ההבדל בין קיבולת הנשימה המקסימלית לנשימה הבסיסית הוא קיבולת הנשימה הרזרבית של התא, המייצג את כמות הנשימה שאינה בשימוש על ידי התא כדי ליצור ATP במצב בסיס, אבל יכול להיות מגויס בתגובה לעליות בביקוש ATP או בתנאים שלמתח 8. הזריקה השלישית היא שילוב של רוטנון ואנטימיצין A. הזרקה זו עוצרת לחלוטין את ETC ו OCR יורד לרמה הנמוכה ביותר שלה, עם צריכת החמצן הנותרת להיות לא מיטוכונדריאלי (נגרמת על ידי NADPH-oxidases, וכו ‘).

שינויים במסלולים מטבוליים יכול איכשהו לחזות את התפקוד של תאי NK, כפי שהוצע כי הפעלה רציפה של תאי NK עם ציטוקינות במבחנה יכול להוביל תשישות תא NK על ידי המחקר של מסלולים מטבולייםשונים 10,11. המתאם בין מצב חילוף החומרים של תא NK ותפקוד חשוב מאוד מנקודת המבט של אימונותרפיה סרטן. בתחום זה, הפעלה של תאי NK עם אינפוזיה של IL-15, לבד או בשילוב עם נוגדנים טיפוליים חד-בוניים נבדקו על מנת לשפר את הרג תאיםסרטניים 12,13,14. הידע של המצב חילוף החומרים של תאי NK בתגובה אסטרטגיות טיפול אלה יספק מנבא יקר של מצב הפעלת תא NK ופונקציית הרג.

המחקר של מסלולים מטבוליים בתאים מיאלואידים ולימפה אחרים כגון מונוציטים, T ו-B תאיםתוארו 15 ושיטות אופטימיזציהפורסמו 16. בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה המשלבת הן פרוטוקול בידוד NK המניב מספרים גבוהים של תאי NK טהורים ו-קיימא ופרוטוקול ממוטב כדי למדוד פעילות מטבולית באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. כאן אנו מראים כי זוהי שיטה חוקית לחקר שינויים מטבוליים במנוחה ו IL-15 מופעל תאי NK אנושיים. עבור אחסון שטף חוץ תאי, פרמטרים כגון מספר תא וריכוזי סמים נבדקו וממוטבים. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי הוא אוטומטי לחלוטין ומצליח לבדוק בזמן אמת, עם כמויות נמוכות מאוד של תאים, עד 92 דגימות בו-זמנית, ובכך מאפשר הקרנות תפוקה גבוהות (עם דגימות מרובות ושכפולים) באופן מהיריחסית 17.

שיטה זו יכולה לשמש חוקרים המעוניינים להעריך את תפקוד תא NK על ידי לימוד חילוף החומרים של תאי NK. זה יכול להיות מיושם גם על תאים המופעלים על ידי ציטוקינות אחרים, נוגדנים או גירויים מסיסים.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להצהרת העקרונות האתיים של הלסינקי למחקר רפואי. דגימות דם היקפיות מתורמים התקבלו מהמחלקה לרפואה עירוי NIH תחת פרוטוקול 99-CC-0168 IRB אישר, עם המטופל בכתב הסכמה מדעת. 1. הכנת ריאה ריגנטים לבידוד תאי NKהערות: הכינו את הריגנטים האלה בשכונה של תר?…

Representative Results

בידוד תאי NK מדם היקפי מספק אוכלוסייה טהורה וכדאית תסוואי השטף החוץ-תאי מבוסס על מדידה של ריכוז H+ ו- O2 בבאר ולא יבחין בין אוכלוסיות שונות של תאים או הכדאיות שלהם. מסיבה זו, השגת אוכלוסייה טהורה מאוד בת קיימא של התא של עניין היה הצעד המרכזי כדי להצליח בניסו?…

Discussion

בנייר זה, הקמנו פרוטוקול לבידוד יעיל וculing טהור וית קיימא תאי NK אנושיים ראשוניים מדם היקפי. יש לנו גם אופטימיזציה התנאים למדידה של הפעילות חילוף החומרים של תאי NK אלה העריכו על ידי קצב צריכת חמצן וקצב חומציות חוץ תאית באמצעות מנתח שטף חוץ תאי. בהשוואה לשיטות התרגם אחרות, מנתח השטף החוץ-תאי מה?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לד”ר מייקל נ. סאק (המכון הלאומי ללב, ריאות ודם) על התמיכה והדיון. מחקר זה נתמך על ידי תוכניות המחקר התוך-ממורל של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לסרטן והמכון הלאומי ללב, ריאות ודם. JT נתמכת על ידי תוכנית רמון y Cajal (להעניק RYC2018-026050-I) של MICINN (ספרד).

Materials

2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O’Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Play Video

Cite This Article
Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

View Video