Exakt brain mapping att utföra repetitiva In Vivo Imaging av neuro-immun dynamik hos möss

Det centrala nervsystemet (CNS) styrs av ett komplext samspel mellan olika inhemska celltyper inklusive nervceller, glia och kärl-associerade celler. Traditionellt studerades neurala celler i isolerade, co-odlade^1,2,,3,,4,5 (in vitro) eller strukits hjärnvävnad (ex vivo)^6,7,8,9,10 sammanhang. Emellertid, Det finns behov av att ytterligare förstå neurala cellen beteende och interaktioner i den inhemska miljön i den intakta hjärnan in vivo. I det här protokollet beskriver vi en metod för att kartlägga in vivo-regioner av intresse och exakt återskapa dessa regioner i framtida bildsessioner för att spåra de komplexa interaktionerna mellan de olika CNS-celltyperna under längre tidsperioder.

Utvecklingen av in vivo imaging metoder har gett betydande vinster för korrekt förståelse av neural funktion^{11,12,13,14,15}. Närmare bestämt ger dessa metoder flera fördelar jämfört med traditionella in vitro- och ex vivo-metoder. För det första har in vivo bildsystem fysiologiskt relevanta cell- och vävnadskomponenter såsom vaskulaturen med hela repertoaren av cellulära interaktioner för att ge en fullständig förståelse av neurala nätverksfysiologi. För det andra, nya rön tyder på att när de tas bort från sin inhemska miljö, vissa neurala celler (såsom microglia) förlorar viktiga funktioner i sin identitet och därmed^{fysiologi 16,17} som kan bevaras i in vivo inställningen. För det tredje, in vivo bildsystem ger möjlighet till stabila longitudinella undersökningar av veckor till månader för att studera CNS cellulära interaktioner. Med tanke på de ökande bevisen för bidrag från det perifera immunsystemet^18,,19 och mikrobiomet^20,,21 i CNS fysiologi, ger in vivo-system en plattform för att förhöra sådana bidrag och effekter på CNS-celler. Således, metoder som använder längsgående in vivo imaging att studera neuro-immun fysiologi och interaktioner i friska, skadade och sjuka tillstånd är ett bra komplement till traditionella metoder.

I detta protokoll beskriver vi en tillförlitlig metod för bild olika celltyper i hjärnan inklusive mikroglia, nervceller och NG2⁺ celler som exempel. Två metoder för att visualisera neurala celler in vivo har utvecklats: den tunnade skallen strategi och den öppna skallen med en kranial fönster strategi. Även tunnas skalle metoder används och är att föredra eftersom de övervinna några av nackdelarna med den öppna skallen strategi såsom glia cell aktivering, högre än fysiologiska ryggraden dynamik och användning av antiinflammatoriska medel^22,23 ,^24,,25, tunnas skalle metoder visar också några kritiska nackdelar.²⁴ För det första är gallringsproceduren ett mycket känsligt förfarande som många forskare har svårt att fullända, särskilt när det är nödvändigt att gallring. Detta beror på att det ofta är svårt för försöksmän att konstatera att de har tunnat skallen till ett ~ 20 μm djup. För det andra, för adekvata jämförelser mellan möss, gallring skulle behöva vara identiska och en mängd gallring framgång mellan imaging sessioner eller möss kan komplicera visualisering av neurala strukturer. För det tredje, när de används för longitudinell avbildning, kan djur med tunna skallar endast användas för ett begränsat antal sessioner när återförtunnande av skallen används. Forth, eftersom en del av benvävnaden fortfarande kvarstår, klarhet på djupet av bildframställning kan äventyras från den tunnade skallen strategi möjliggör stor visualisering av mer ytliga men inte så mycket med djupare regioner. Mot bakgrund av detta kan djupare hjärnstrukturer som hippocampus inte framgångsrikt avbildas med den tunnade skallen. Dessa överväganden ger upphov till behovet av alternativa och kompletterande tillvägagångssätt som skulle kunna övervinna dessa farhågor.

Alternativ till den tunnade skallen strategi, den öppna skallen fönster implantation tillvägagångssätt använder ett förfarande där skallen ersätts med ett optiskt klart glas täcket. Detta möjliggör ett nästan obegränsat antal bildsessioner. Dessutom, med tanke på byte av skallen med glas täcket, denna metod möjliggör en tydlig visning fönster fluorescerande taggade hjärnceller under långa perioder från timmar till månader och därför kan användas för att studera cellaktivitet och interaktioner som är relevanta för fysiologi, åldrande och patologi.

Sammantaget detalj vi steg som kan följas för att göra implantat kronisk kranial fönster genom en stereotaxic craniotomy som möjliggör in vivo imaging av hjärnan regioner av intresse. Vi beskriver också hur den grovt stabila hjärnan vasculature eller fluorescerande märkta dendriter kan användas för att generera en grov eller en fin karta, respektive av hjärnan regioner av intresse. Den här metoden kan sedan användas för upprepad avbildning under flera sessioner. Vikten av denna teknik ligger därför i dess förmåga att avbilda de långsiktiga förändringarna eller stasis i hjärnans element inklusive arrangemang, morfologi, och interaktioner av de olika cellulära typer.