Detta protokoll beskriver en kronisk hjärnskålen fönster implantation teknik som kan användas för longitudinell avbildning av neuro-glio-vaskulära strukturer, interaktioner och funktion i både friska och sjuka villkor. Det fungerar som ett komplement till den transkraniella bildbehandling strategi som, även om det ofta föredras, besitter vissa kritiska begränsningar.
Det centrala nervsystemet (CNS) regleras av ett komplext samspel mellan neuronala, glia, stromala och vaskulära celler som underlättar dess korrekta funktion. Även om studera dessa celler i isolering in vitro eller tillsammans ex vivo ger användbar fysiologisk information; framträdande funktioner i neural cellfysiologi kommer att saknas i sådana sammanhang. Därför finns det ett behov av att studera neurala celler i deras inhemska in vivo-miljö. Protokollet beskrivs här beskriver repetitiva in vivo två foton imaging av neurala celler i gnagare cortex som ett verktyg för att visualisera och studera specifika celler under längre tidsperioder från timmar till månader. Vi beskriver i detalj användningen av den grovt stabila hjärnan vasculature som en grov karta eller fluorescerande märkta dendriter som en fin karta över utvalda hjärnan regioner av intresse. Med hjälp av dessa kartor som en visuell nyckel visar vi hur neurala celler kan flyttas exakt för efterföljande repetitiva in vivo imaging. Med hjälp av exempel på in vivo imaging av fluorescerande märkta mikroglia, nervceller och NG2+ celler, detta protokoll visar förmågan hos denna teknik för att möjliggöra repetitiva visualisering av cellulära dynamik i samma hjärnan plats under längre tidsperioder, som ytterligare kan bidra till att förstå de strukturella och funktionella svar av dessa celler i normal fysiologi eller följande patologiska förolämpningar. Vid behov kan detta tillvägagångssätt kopplas till funktionell avbildning av neurala celler, t.ex. Detta tillvägagångssätt är särskilt en kraftfull teknik för att visualisera den fysiska interaktionen mellan olika celltyper av CNS in vivo när genetiska musmodeller eller specifika färgämnen med distinkta fluorescerande taggar för att märka de celler av intresse finns tillgängliga.
Det centrala nervsystemet (CNS) styrs av ett komplext samspel mellan olika inhemska celltyper inklusive nervceller, glia och kärl-associerade celler. Traditionellt studerades neurala celler i isolerade, co-odlade1,2,,3,,4,5 (in vitro) eller strukits hjärnvävnad (ex vivo)6,7,8,9,10 sammanhang. Emellertid, Det finns behov av att ytterligare förstå neurala cellen beteende och interaktioner i den inhemska miljön i den intakta hjärnan in vivo. I det här protokollet beskriver vi en metod för att kartlägga in vivo-regioner av intresse och exakt återskapa dessa regioner i framtida bildsessioner för att spåra de komplexa interaktionerna mellan de olika CNS-celltyperna under längre tidsperioder.
Utvecklingen av in vivo imaging metoder har gett betydande vinster för korrekt förståelse av neural funktion11,12,13,14,15. Närmare bestämt ger dessa metoder flera fördelar jämfört med traditionella in vitro- och ex vivo-metoder. För det första har in vivo bildsystem fysiologiskt relevanta cell- och vävnadskomponenter såsom vaskulaturen med hela repertoaren av cellulära interaktioner för att ge en fullständig förståelse av neurala nätverksfysiologi. För det andra, nya rön tyder på att när de tas bort från sin inhemska miljö, vissa neurala celler (såsom microglia) förlorar viktiga funktioner i sin identitet och därmedfysiologi 16,17 som kan bevaras i in vivo inställningen. För det tredje, in vivo bildsystem ger möjlighet till stabila longitudinella undersökningar av veckor till månader för att studera CNS cellulära interaktioner. Med tanke på de ökande bevisen för bidrag från det perifera immunsystemet18,,19 och mikrobiomet20,,21 i CNS fysiologi, ger in vivo-system en plattform för att förhöra sådana bidrag och effekter på CNS-celler. Således, metoder som använder längsgående in vivo imaging att studera neuro-immun fysiologi och interaktioner i friska, skadade och sjuka tillstånd är ett bra komplement till traditionella metoder.
I detta protokoll beskriver vi en tillförlitlig metod för bild olika celltyper i hjärnan inklusive mikroglia, nervceller och NG2+ celler som exempel. Två metoder för att visualisera neurala celler in vivo har utvecklats: den tunnade skallen strategi och den öppna skallen med en kranial fönster strategi. Även tunnas skalle metoder används och är att föredra eftersom de övervinna några av nackdelarna med den öppna skallen strategi såsom glia cell aktivering, högre än fysiologiska ryggraden dynamik och användning av antiinflammatoriska medel22,23 ,24,,25, tunnas skalle metoder visar också några kritiska nackdelar.24 För det första är gallringsproceduren ett mycket känsligt förfarande som många forskare har svårt att fullända, särskilt när det är nödvändigt att gallring. Detta beror på att det ofta är svårt för försöksmän att konstatera att de har tunnat skallen till ett ~ 20 μm djup. För det andra, för adekvata jämförelser mellan möss, gallring skulle behöva vara identiska och en mängd gallring framgång mellan imaging sessioner eller möss kan komplicera visualisering av neurala strukturer. För det tredje, när de används för longitudinell avbildning, kan djur med tunna skallar endast användas för ett begränsat antal sessioner när återförtunnande av skallen används. Forth, eftersom en del av benvävnaden fortfarande kvarstår, klarhet på djupet av bildframställning kan äventyras från den tunnade skallen strategi möjliggör stor visualisering av mer ytliga men inte så mycket med djupare regioner. Mot bakgrund av detta kan djupare hjärnstrukturer som hippocampus inte framgångsrikt avbildas med den tunnade skallen. Dessa överväganden ger upphov till behovet av alternativa och kompletterande tillvägagångssätt som skulle kunna övervinna dessa farhågor.
Alternativ till den tunnade skallen strategi, den öppna skallen fönster implantation tillvägagångssätt använder ett förfarande där skallen ersätts med ett optiskt klart glas täcket. Detta möjliggör ett nästan obegränsat antal bildsessioner. Dessutom, med tanke på byte av skallen med glas täcket, denna metod möjliggör en tydlig visning fönster fluorescerande taggade hjärnceller under långa perioder från timmar till månader och därför kan användas för att studera cellaktivitet och interaktioner som är relevanta för fysiologi, åldrande och patologi.
Sammantaget detalj vi steg som kan följas för att göra implantat kronisk kranial fönster genom en stereotaxic craniotomy som möjliggör in vivo imaging av hjärnan regioner av intresse. Vi beskriver också hur den grovt stabila hjärnan vasculature eller fluorescerande märkta dendriter kan användas för att generera en grov eller en fin karta, respektive av hjärnan regioner av intresse. Den här metoden kan sedan användas för upprepad avbildning under flera sessioner. Vikten av denna teknik ligger därför i dess förmåga att avbilda de långsiktiga förändringarna eller stasis i hjärnans element inklusive arrangemang, morfologi, och interaktioner av de olika cellulära typer.
Tillkomsten av in vivo två foton imaging har öppnat möjligheter att utforska den uppsjö av cellulära interaktioner och dynamik som uppstår i den friska hjärnan. Inledande studier fokuserade på att använda den öppna skallen craniotomy strategi för bild neuronala dendriter av både akut och kronisk avbildning37,38. Detta kan också användas för att belysa neuroimmun interaktioner i hjärnan. Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig avbild…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i Eyo labbet för att diskutera de idéer som presenteras i detta manuskript. Vi tackar Dr Justin Rustenhoven från Kipnis Lab vid University of Virginia för gåvan av NG2DsRed möss33. Detta arbete stöds av finansiering från National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health till U.B.E (K22 NS104392).
Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |