마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑
Summary
이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.
Abstract
중추 신경계 (CNS)는 적절한 기능을 용이하게하는 신경, 신경교, 기질 및 혈관 세포의 복잡한 상호 작용에 의해 조절됩니다. 비록 시험관 내 또는 함께 전 생체 내에서 격리에서 이러한 세포를 연구 하는 데 유용한 생리 정보를 제공; 신경 세포 생리학의 현저한 특징은 그러한 맥락에서 놓칠 것입니다. 따라서 생체 내 환경에서 자신의 네이티브신경 세포를 연구할 필요가 있다. 여기에서 상세한 프로토콜은 설치류 피질에 있는 신경 세포의 생체 내 2광자 화상 진찰에 있는 반복적인 기술하고 시간에서 달에 시간의 연장된 기간 동안 특정 세포를 구상하고 공부하기 위한 공구로 설명합니다. 우리는 거친지도 또는 형광으로 표시된 원원자로 심하게 안정된 뇌 혈관의 사용을 관심있는 일부 뇌 영역의 미세한지도로 자세히 설명합니다. 이러한 맵을 시각적 키로 사용하여, 우리는 어떻게 신경 세포가 생체 내 이미징에서 후속 반복을 위해 정확하게 재배치될 수 있는지 보여줍니다. 형광 표지 된 마이크로글리아, 뉴런 및 NG2+ 세포의 생체 내 이미징의 예를 사용하여,이 프로토콜은 장기간 에 걸쳐 동일한 뇌 위치에서 세포 역학의 반복적 인 시각화를 허용하는이 기술의 능력을 보여 주며, 이는 정상적인 생리학 또는 다음 병리학 적 모욕에서 이러한 세포의 구조적 및 기능적 반응을 이해하는 데 더 도움이 될 수 있습니다. 필요한 경우, 이 접근법은 신경 세포의 기능적 이미징(예: 칼슘 이미징)과 결합될 수 있습니다. 이 접근법은 특히 유전 마우스 모델 또는 관심있는 세포를 라벨화하기 위해 뚜렷한 형광 태그가있는 특정 염료가 있는 생체 내의 CNS의 다른 세포 유형 간의 물리적 상호 작용을 시각화하는 강력한 기술입니다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)는 뉴런, glia 및 혈관 관련 세포를 포함한 다양한 상주 세포 유형 간의 상호 작용의 복잡한 상호 작용에 의해 지배된다. 전통적으로 신경세포는 분리, 공동 배양1,,2,,3,4,4,5(시험관내) 또는 절제된 뇌 조직(ex vivo)5 6,,7,,8,,9,,10개의 문맥에서 연구되었다. 그러나, 생체 내에서 온전한 뇌의 네이티브 환경에서 신경 세포 행동과 상호 작용을 더 이해할 필요가 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 관심있는 생체 영역에서 매핑하고 오랜 기간 동안 다양한 CNS 세포 유형 사이의 복잡한 상호 작용을 추적하기 위해 향후 이미징 세션에서 해당 영역을 정확하게 다시 이미지하는 방법을 설명합니다.
생체 내 이미징 접근법의 발달은 신경,기능(11,,12,13,14,,15)의 적절한 이해를 위해 상당한 이득을제공했습니다., 특히, 이러한 접근 방식은 기존의 체외 및 ex vivo 접근 방식에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 생체 내 이미징 시스템은 신경망 생리학의 완전한 이해를 제공하기 위해 세포 상호 작용의 전체 레퍼토리와 혈관과 같은 생리학적으로 관련된 세포 및 조직 성분을 갖는다. 둘째, 최근 연구 결과는 그들의 네이티브 환경에서 제거될 때, 특정 신경 세포 (microglia와 같은)가 생체 내 설정에서 보존될 수 있는 그들의 정체성 및 따라서 생리학16,,17의 중요한 특징을 분실한다는 것을 건의합니다. 셋째, 생체 내 이미징 시스템은 CNS 세포 상호 작용을 연구하기 위해 몇 주에서 몇 달까지의 안정적인 세로 조사를 위한 기회를 제공합니다. 마지막으로, CNS 생리학에서 말초 면역 계통18,,19 및 미생물군유전체20,,21의 기여도에 대한 증가증거를 감안할 때, 생체 내 시스템은 CNS 세포에 대한 그러한 기여와 효과를 심문하는 플랫폼을 제공한다. 따라서, 건강, 부상 및 질병 상태에서 신경 면역 생리학 및 상호 작용을 연구하기 위하여 생체 내 화상 진찰에 있는 세로를 사용하는 접근은 전통적인 접근에 큰 보완적인 추가입니다.
이 프로토콜에서, 우리는 예로 마이크로글리아, 뉴런 및 NG2+ 세포를 포함하여 두뇌에 있는 다른 세포 모형을 이미지하는 믿을 수 있는 접근법을 기술합니다. 생체 내 신경 세포를 시각화하는 두 가지 접근법이 개발되었습니다: 얇은 두개골 접근법과 두개골 창 접근법을 가진 열린 두개골. 얇은 두개골 접근법이 사용 중이며 신경교 세포 활성화, 생리학적 척추 역학 및 항 염증제22,,23,,24,,25,얇은 두개골 접근법과 같은 열린 두개골 접근법의 단점 중 일부를 극복하기 때문에 선호되지만 얇은 두개골 접근법은 또한 몇 가지 중요한 단점을 보여줍니다. 첫째, 숱이 절차는 많은 연구원이 재 숱이 필요할 때 특히 완벽하기 어려운 것을 찾아는 아주 섬세한 절차입니다. 이것은 실험자가 두개골을 ~20 μm 깊이로 얇게 했다는 것을 확인하기가 어렵기 때문입니다. 둘째, 마우스 사이의 적절한 비교를 위해, 숱이 동일해야 하고 화상 진찰 세션 또는 마우스 사이 숱이 성공의 다양한 신경 구조물의 시각화를 복잡하게 할 수 있었습니다. 셋째, 세로 화상 진찰에 사용될 때, 얇은 두개골을 가진 동물은 두개골의 재숱이 채택될 때 세션의 제한된 수에만 사용될 수 있습니다. 포스, 뼈 조직의 일부는 여전히 남아 있기 때문에, 이미징의 깊이에 선명도 더 피상적이지만 더 깊은 영역만큼 많은 것을 허용 얇은 두개골 접근에서 손상 될 수 있습니다. 이에 비추어 해마와 같은 더 깊은 뇌 구조는 얇은 두개골 접근법으로 성공적으로 이미지화 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항은 이러한 우려를 극복할 수 있는 대안적이고 보완적인 접근법의 필요성을 제기합니다.
얇은 두개골 접근법에 대한 대안으로, 열린 두개골 창 이식 접근법은 두개골을 광학적으로 맑은 유리 커버슬립으로 대체하는 절차를 사용합니다. 이를 통해 거의 무제한의 이미징 세션을 허용합니다. 더욱이, 유리 커버슬립으로 두개골을 교체하는 것을 감안할 때, 이 방법은 몇 시간에서 달까지 광범위한 기간 동안 형광 태그된 뇌 세포의 명확한 보기 창을 허용하고, 따라서 생리학, 노화 및 병리학과 관련된 세포 활동 및 상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
전반적으로, 우리는 관심있는 두뇌 지구의 생체 내 화상 진찰을 가능하게 하는 입체 적인 두개골 절제술을 통해 임플란트 만성 두개골 창을 하기 위하여 따를 수 있는 단계를 상세히 설명합니다. 우리는 또한 어떻게 심하게 안정된 두뇌 혈관 또는 형광으로 표시된 원더라이트가 관심있는 두뇌 지구의 각각 거친 또는 미세지도를 생성하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근 은 다음 여러 세션에 반복 된 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 기술의 중요성은, 그러므로, 다른 세포 모형의 배열, 형태학 및 상호 작용을 포함하여 두뇌 요소에 있는 장기 변경 또는 정지를 이미지하는 기능에 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 내 2광자 이미징의 출현은 건강한 뇌에서 발생하는 세포 상호 작용과 역학의 과다를 탐구 할 수있는 기회를 열었습니다. 초기 연구는 급성 및 만성 이미징37, 38모두에,의해 심신경 원더라이트를 이미지에 개방 두개골 두개골 절제술 접근법을 사용하는 데 초점을맞췄다. 이것은 또한 두뇌에 있는 신경 면역 상호 작용을 해명하기 위하여 이용될 수 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고에 제시된 아이디어에 대해 논의해 주신 에요랩 회원들에게 감사드립니다. 우리는 NG2DsRed 마우스33의선물에 대한 버지니아 대학의 Kipnis 연구소에서 박사 저스틴 Rustenhoven 감사합니다. 이 작품은 U.B.E (K22 NS104392)에 건강의 국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 자금지원.
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 신경과학. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
