הדמיה סופר-רזולוציה ללמוד התאמה ית-מקומית של חלבונים וסמנים סינפטיים בנוירונים ראשוניים
Summary
פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.
Abstract
סינמפסות הן האלמנטים הפונקציונליים של נוירונים והפגמים או ההפסדים שלהם הם על בסיס מספר הפרעות ניווניות ונוירולוגיות. מחקרי הדמיה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תפקודם ואת הפלסטיות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בשל גודלם ומבנהם, מחקרי ים-ים של חלבונים דורשים טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך ללמוד נוירונים ראשוניים התאמה יתיקות של חלבוני היעד עם סמנים סינפטיים ברמת סופר רזולוציה באמצעות מיקרוסקופית תאורה מובנית (SIM). SIM היא טכניקת תאורה בדוגמת אור המכפילה את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ שדה רחב, ומגיעה לפרטים של כ-100 00 00 00 00 00 00 00:00. הפרוטוקול מציין את הפקדים וההגדרות הנדרשים עבור מחקרי התאמה יתקליזציה איתנים ודה-טה-תס על השיטות הסטטיסטיות לניתוח נתוני ההדמיה כראוי.
Introduction
ההבנה והתצוגה של הסינסה השתנו מאוד מאז התיאור הראשון של פוסטר ושרינגטון ב-18971. מאז, הידע שלנו בתקשורת עצבית והתהליכים המולקולריים שמאחוריה גדל באופן אקספוננציאלי2. זה הפך להיות ברור כי סינפסות ניתן לחשוב כמערכת דו-תאים: תא טרום סינפטי המכיל שלוקות לשחרור של נוירוטרנסמיטורים ותאי פוסט-סינפטי עם קולטנים3. השקפה פשטנית זו, בעשרים השנים האחרונות, התפתחה לרשת מורכבת של החלבונים הנדרשים כדי להעביר את המשדר המחייב לאותת4.
הרווחים בהבנה נובעים בחלקם מטכניקות סופר-רזולוציה שהתגברו על מגבלת הפליטה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי להתאים לממד של סינאפסותטוב יותר 5,6,7,8,,9,,10. בשל מגבלת הפליטה, מיקרוסקופ אופטי אינו יכול להגיע לרזולוציה מעל 200 00 0000 00:00:00,000———————————————————,12 כדי לעקוף מגבלה זו, טכניקות סופר רזולוציה נוצרו, באמצעות גישות שונות ולהגיע לרזולוציות שונות של מגבלת תת-עקיפה: SIM, STED (מיקרוסקופית דלדול פליטה מגורה), PALM (מיקרוסקופית התאמה מקומית PhotoActivated) ו- STORM(מיקרוסקופשחזור אופטי סטוכסטי) 13,14. SIM מכפיל את הרזולוציה המרחבית של מערכות מיקרוסקופיות רחבות שדה מבוססות לייזר על-ידי הכנסת חיתוך צורב לנתיב קרן העירור15. הסורג הניתן להזזה מדרג את קרני הלייזר כדי ליצור תבנית תאורה ידועה, בדרך כלל פסים. תבנית אור מובנית בכוונה זו על-תפוצה מרחבית לא ידועה של צבע הפלורסנט (של הדגימה). שולי ההפרעה שנוצרו על ידי שני דפוסים מקודדים לפרטים עדינים שלא ניתן להבחין בהם עם מיקרוסקופיה רגילה בשטח רחב. התמונה הסופית סופר נפתרה מתקבלת על ידי שילוב ופענוח עם שיטות מתמטיות מספר תמונות גלם של אותה מדגם שהושג על ידי התרגומים והסבבים של סורג iffraction. הרזולוציה של תמונות סופר נפתרו מגיע 100 נמימה ל-500 נארם בהוראות axial עבור 2D-SIM15 או 100 נה”מ לדרבי ו 250 נה”מ בהוראות axial עבור 3D-SIM16.
ההבנה החדשה של הסינאפסה חשובה עוד יותר לאור ההפרעות הנוירולוגיות הרבות שבהן תפקוד לקוי של הסינאפטי ממלא תפקיד מרכזי בהתחלהובהתקדמות 17,18. מחלת אלצהיימר, תסמונת דאון, מחלת פרקינסון, מחלות פריון, אפילפסיה, הפרעות בספקטרום האוטיזם ותסמונת X שברירי בין היתר קושרו לחריגות בהרכב סינפטי, מורפולוגיה ותפקוד19,20,21,22.
לאחרונה, באמצעות קבוצה של נוגדנים ספציפיים SUMO, השתמשנו SIM כדי להראות התאמה לשפות אחרות בנוירונים היפוקמפוס ראשוניים של חלבוני SUMO עם סינפטופיזין סמנים לפני ופוסט סינפטי ו PSD95 ברמת סופר רזולוציה23. זה איפשר לנו לאשר ראיות ביוכימיות ומיקרוסקופיות קונפוקליות של התאמה סומו לנוירונים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה של חלבונים בנוירונים ראשוניים היפוקמפוס העכבר. במקביל, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לסוגים שונים של תרבויות עצביות עיקריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההכלה של המבנה וההרכב של הסינסה חיונית להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים המווסתים את הזיכרון וההכרה. בעוד במצב נורמלי, סינופסות הן אבני הבניין של זיכרון, הם גם בבסיס הפרעות נוירולוגיות מורכבות כגון מחלת אלצהיימר32. הפרוטוקול המתואר כאן משמש לחקר ההתיקות הליקוטית של חל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לאדוארדו מיצוטי על הביקורת הבונה על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי BrightFocus A2019296F, על ידי פונדו די Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), על ידי Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ועל ידי מארי Skłodowska-Curie חדשני הדרכה רשת (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
