CRISPR-Cas9インターメディエートゲノム編集における糸状アスコミセテ ・ハンティエラオマネンシス

1. sgRNAの設計と合成 sgRNAの一部を形成する潜在的なプロトスペーサー領域を特定するには、使用されているプログラムの検索機能を使用して、5′ NGG 3′ 三つ子の対象遺伝子を手動で検索します。これらの三つ子を PAM シーケンスとしてアセトします。注: PAM およびプロトスペースのシーケンスを検索して注釈を付けるさまざまなソフトウェア プログラムが用意されています。 識別された各 PAM シーケンスの 20 bp アップストリームを選択し、これらのシーケンスに潜在的なプロトスペースとしてコメントを付けます。 1 つのプロトスペースを決定するには、次のフィルタリング手順を実行して、低品質のシーケンスを破棄します。 潜在的なプロトスペーサの特異性をテストするには、PAM配列とプロトスペーサを1つの配列に組み合わせて、ゲノム全体に対するBLASTnクエリとして使用します。標的領域以外のゲノム内の任意の領域と類似性を示すプロトスペイサーを廃棄する(図1A)。 RNA分子がCas9酵素に結合するための正しい3D構造に折り畳まれるようにするために、Cas9酵素に固有のプロトスペーサーと足場配列を含む結合配列を作成します。 組み合わされた各プロトススペースス-足場配列をRNA二次構造予測ツール(材料表)にアップロードします。 最小の自由エネルギーと中心の二次構造を比較して結果を分析します。注:理想的なプロトスペーサ候補は、同一の最小の自由エネルギーと心の二次構造を持つことになります。両方の二次構造は、5つのリング構造によって中断された3つのステムループで構成されるべきです。構造はまた、プロトスペースを表す領域を除いて、構造全体にわたって高い結合確率(赤で示される)を示す必要があります(図1B)。実際のエネルギー値は関係ありません。 対象となる特定のリージョンに最も近い候補を選択して、上記のフィルタリング手順に合格した候補から最終的な候補を選択します。 単一のRNA分子としてsgRNAを合成するには、使用される特定のCas9酵素と互換性のあるsgRNA合成キット(材料表s)を使用する(例えば、 レンサ球菌のpyogenesからCas9)。注: 以下の手順は、使用する sgRNA 合成キットに依存する場合があります。別のキットが使用された場合は、製造元の指示に従ってください。あるいは、sgRNAを、予め合成してオーダーすることができる。RNAを使用する場合は、ヌクレアーゼフリー試薬と使い捨て薬を使用してください。 上記のステップ 1.3 で選択した 20 bp のプロトスペースが 5′ の終わりに G を収容しない場合は、この領域に G を追加します。 T7プロモーター配列をターゲット配列の5’末端に追加します。このシーケンスは標準であり、5′ TTCTAATACGACTCACTATAG 3′ です。 ターゲット シーケンスの 3′ 末尾に 14 nt のオーバーラップ シーケンスを追加します。このシーケンスはキット固有で、ここで使用されるキット用の5′ GTTTTAGAGCTAGA 3′ です。 得られたフラグメント5’TTCTAATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGAをオーダーし、選択したプロトスペーサを表す(N)20を使用して、あらかじめ合成されたプロトスペーサを表す(材料表)。20 20 製造者のプロトコル(材料表)に従い、2μLの水、10μLの反応緩衝液、5μLの合成プロトスペーサー配列、0.1 M DTTの1μLおよび2μLのトランスクリプト酵素を室温で組み合わせます。 この溶液を37°Cで30分間インキュベートし、氷に移します。 30 μLの水と2 μLのDNase Iを加え、37°Cで混合してインキュベートし、さらに15分間インキュベートします。 得られたsgRNAを2%アガロースゲルで可視化します。 2. sgRNAの インビトロ 切断能力の試験 注: この手順はオプションですが、推奨されます。 選択したsgRNAが標的とする部位の配列を有する断片を増幅するプライマーを設計し、標準的なDNAポリメラーゼを用いて領域を増幅する。注:可能であれば、ターゲット部位で切断が標準的なアガロースゲル上で互いに容易に区別することができる非常に異なるサイズの2つの断片を生成するような方法でプライマーを設計する。 上記合成した30 nM sgRNAからなる溶液、30 nM Cas9タンパク質、10x反応バッファー、10μLの水を10分間、20分間、結合したsgRNA-Cas9リボヌクレオプロテイン(RNP)を組み立てます。 標的領域のPCR産物をRNP溶液に加えて、3nMの最終濃度に添加することにより、sgRNAの切断能力を試験します。 37°Cで15分間インキュベートします。 溶液に3μgのプロテイナーゼKと2μgのRNaseを加えて、切断反応を停止し、室温で10分間インキュベートします。 得られたDNA断片を2%アガロースゲルで可視化します。sgRNAは、期待サイズの2つのバンドがゲルに観察される場合の インビボ 実験に適している。 3. dDNAの設計と合成 標的とされるゲノム領域との相補性を持つ3つの領域-5’および3’領域と選択可能なマーカーを収容する中間領域で構成されるdDNAを設計する(材料表、図2)。注: この選択可能なマーカーには、他の特定のシーケンスを追加することもできます。この特定の実験では、選択マーカーの直前に停止コドン配列(5’TGA 3′)を加え、インフレームストップコドンを遺伝子に導入した。dDNAは、事前合成をオーダーすることができます。あるいは、dDNAを段階的に使用して増幅および組み立てることができ、以下に詳述するPCRアプローチが重複する。 5’と3’の隣接する領域の約800 bpを増幅するプライマーを設計します。選択可能なマーカーのシーケンスを補意とする 20 nt のシーケンスを、5′ 領域の逆プライマーと 3′ 領域のフォワードプライマーに追加します。 選択可能なマーカーを増幅するプライマーを設計し、増幅された生成物が抵抗性遺伝子を収容し、また目的の種で働くことを知られているプロモーターを収容することを保証する。 高忠実度のDNAポリメラーゼ(材料表)を使用して、3つのdDNA領域を増幅します。編集中の生物のgDNAから5’と3’の領域を増幅する。関連するソースから選択可能なマーカーを増幅します。 単一の反応で、増幅された5’領域を選択マーカーと組み合わせ、長い範囲の高忠実度DNAポリメラーゼを使用して、領域全体を増幅する。 第2の単一の反応では、増幅された3’領域を選択マーカーと組み合わせ、長い範囲の高忠実度DNAポリメラーゼを使用して、領域全体を増幅する。 最後に、上記の 2 つの PCR 製品を 1 つの反応に組み合わせ、dDNA 配列全体を、長い範囲の高忠実度 DNA ポリメラーゼで増幅します。 1%アガロースゲル上のDNA断片を可視化します。2つ以上のフラグメントが生成された場合は、ゲル精製キットを用いてゲルから正しいサイズの断片を精製する。 4. プロトプラストの抽出 コニディアを製造するには、1cm x 1 cmのミセリアで覆われた寒天ブロックを有する500 mLフラスコに200mLの新鮮な2%麦芽エキスブロス(MEB)を接種する。注:すべての真菌がコニディアを生成できるわけではありません。その場合、ミセリアも使用できます。これは通常、プロトコルでさらに高濃度の酵素を取り付ける必要があります。 25°Cの振盪インキュベーターで液体培養液を24~48時間120rpmで振盪してインキュベートする。注意:このインキュベーション時間と温度は 、H. オマネンシスに最適化されています。これは、他の種のために最適化する必要があります。 コニディアを収穫する。滅菌実験布(例えば、ミラクロス)の層を通して液体培養物を濾過し、10分間4°Cで3,220 x g で50 mL遠心管と遠心分離機に対して、円筒懸濁液を移す。上清を捨てます。 5 mLの水とピペット10 μLの水を顕微鏡スライドに再懸濁し、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、コニディアのみが回収されたことを確認する(図3A)。 500 mL フラスコで、再懸濁されたコニディアの総容積で200 mLの新鮮な1%MEBを接種する。 25°Cの振盪インキュベーターで液体培養液を120rpmで最大12時間振盪してインキュベートします。注意: このインキュベーション時間は 、H. オマネンシスに最適化されています。これは、他の種のために最適化する必要があります。 胚芽を収穫するには、液体培養物を50mL遠心管に移し、遠心分離機を3,220 x g で4°Cで10分間移す。上清を捨てます。 1 Mソルビトールの10 mLまでで発芽を再懸濁します。 10 μLの胚芽液を顕微鏡スライドに入れ、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、胚芽のみが回収されたことを確認します(図3B)。注: プロトコルはここで一時停止することができます。-80°Cで1 Mソルビトールに胚芽を保管してください。 若い胚芽の細胞壁を取り消し、プロトプラストを放出するには、無菌50mLフラスコの様々な濃度で9mLの酵素をライジングする酵素の1mLを加える。注:異なる酵素濃度およびインキュベーション時間が使用され、 表1に記載されています。酵素および濃度は真菌によっても変わる可能性があり、種ごとに最適化する必要があります。 25°Cの振盪インキュベーターに胞子酵素溶液をインキュベートし、80rpmで2〜3時間振動する。 無菌実験室布の層を通してプロトプラスト溶液を濾過し、10分間4°Cで1,810 x g で遠心分離によってプロトプラストを収集します。上清を捨てます。メモ:プロトプラストは細胞壁のない細胞であるため、機械的な破壊に非常に敏感です。特にピペットの場合は、慎重に取り扱ってください。 200 μLのSTCバッファにプロトプラストペレットを慎重に再懸濁します(材料表)。 プロトプラスト溶液のピペット10 μLを顕微鏡スライドに取り付け、カバースリップで覆います。40倍の倍率で複合顕微鏡を使用して視覚化し、プロトプラストのみが回収されたことを確認します(図3C)。 ヘモサイトメーターを使用して、上記のステップで生成されたプロトプラストの数をカウントし、計算します。プロトプラスト溶液を約5 x 106 のプロトプラストを含むアリコートに希釈します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。プロトプラストを-80 °CのSTCバッファーに保管してください。 5. プロトプラストとPEG支援変換と変換性回復 変換を開始するには、約5 x 106 のプロトプラストをRNP溶液の単一のボリュームと、約6μgのdDNA断片と組み合わせます。メモ:プロトプラストは機械的な破壊に非常に敏感です。特にピペットの場合は、慎重に取り扱ってください。 ピペットを使用して、作りたての30%PTC溶液をプロトプラスト溶液にゆっくりと滴下し、室温で20分間インキュベートします。注: この手順は、重要で重要な手順です。作りたてのPTC溶液を使用し、細胞表面全体に疎水性の層を作成し、できるだけゆっくりと均等に細胞の上に溶液をドロップすることを確認してください。 プロトプラスト溶液に5mLの浸透制御培地(OCM)を加え、ピペットをゆっくりと穏やかに加え、溶液が完全に混合されていることを確認します。 プロトプラスト溶液を25°Cの揺れインキュベーターにインキュベートし、一晩で80rpmで振盪します。 変換された分離物を選択するには、溶液を5つの空の60mm培養プレートに分割します。 各培養プレートに30 μg/mLハイグロマイシンBを添加したOCM寒天10mLを加え、各プレートをゆっくりと回転させて完全に混合します。 40 μg/mL ハイグロマイシン B を添加した浸透性制御培地寒天の 10 mL を追加する前に、寒天の第 1 層を設定します。 寒天の2番目の層は、単一の分離物が寒天の両方の層を介して成長するのを見ることができるまで、25°Cで培養物を設定し、インキュベートすることを可能にする。 正常に形質転換された分離株を回復するために、40 μg/mL ハイグロマイシン B を補った寒天層を介して成長可能な個々の分離株を、50 μg/mL ハイグロマイシン B (MEA-50) を加えた新鮮な麦芽エキス寒天 (MEA) プレートに移します。 生鮮文化を25°Cで5日間インキュベートし、毎日成長をチェックします。このメディアで持続的な成長が可能な文化は正常に変換され、さらなる研究に使用することができます。 6. dDNAの統合と安定性の確認 dDNAが標的領域のゲノムに統合されたことを確認するために、予測された5’および3’インサート部位に隣接するプライマーを設計する(図2)。 これら2つのプライマーセットと高忠実度DNAポリメラーゼを使用して2つのPCRを実行します。両方のPCRが期待されるサイズとシーケンスのアンプリコンを生成する場合、dDNAはターゲット領域に正常に統合されました。次に、dDNAの安定した集積について変異染色を評価する。 dDNAが安定してゲノムに統合され、栄養成長の間に維持されることを確認するために、メディア転送試験を行う。 MEA-50培地上で活発に成長している変異体分離物から無補充MEA培地に、骨髄で覆われた寒天のブロックを移す。25°Cで3日間インキュベートします。 MEA培地上で成長している分離株からMEA-50培地にミセリアで覆われた寒天のブロックを移す。25°Cで3日間インキュベートします。 このプロセスを繰り返します, 少なくとも 4 ラウンドの補充された培地に補充から積極的に成長しているミセリアを転送.注:多くの転写後に単離体がMEA-50培地上で持続的な成長が可能な場合、dDNAはゲノムに安定的に統合されており、栄養成長によって維持することができます。変異染色は、統合されたdDNAの単一のコピーの存在を評価することができる。 dDNAが単一の場所でゲノムに統合されたことを確認するために、サザンブロット分析を行います。 Hin dIIIおよびEcoRI制限酵素を使用して、各Hin変異株から合計30 μgのgDNAを製造者のプロトコルに従って消化します。注:制限酵素の選択は研究者次第ですが、制限酵素の認識部位がdDNA配列に存在しないことを確認してください。 消化したgDNAを0.75%アガロースゲルで分離し、標準的な手順32を使用してDNAをナイロン膜に移す。 dDNA配列を標的とするプローブを用いて膜をハイブリダイゼーションに供する。 dDNAの短い(300 bp)領域を増幅するようにプライマーを設計する。 これらのプライマーを用いて、PCR DIG標識ミックスを用いてプローブを合成する。 新たに合成されたプローブを使用して、膜ハイブリダイゼーション、処理、視覚化を標準手順32を使用します。各レーンに1つのバンドしか見られない場合、dDNAはゲノム内の単一の位置にのみ存在します。変異株は、さらなるフェノティピック解析および機能的特性解析実験に使用できるようになりました。 変異株の7.フェヒーチピック解析 MAT遺伝子の破壊が研究されている真菌の性的能力に影響を与えたかどうかを判断するために交配実験を行う。注:このステップは、研究されている特定の遺伝子および種に依存します。この場合、標的化している遺伝子は性生殖に関与していると考えられるため、交配試験が行われた。例えば、遺伝子が無性生殖に関与していると考えられるならば、心筋産生のようなものを測定することができる。 変異株のヘテロスアリック能力を試験するために、変異株と同様に反対交配型の株を有する新鮮なMEA培地を共に接種する。 オマネンシスの場合は、プレートの蓋を閉じたままにしますが、密封せず、室温で7日間インキュベートしてください。性的構造の生産を視覚的に評価する。 変異株のホモタール性能力を試験するために、変異株を有する新鮮なMEA培地を接種する。 オマネンシスの場合は、プレートの蓋を閉じたままにしますが、密封せず、室温で7日間インキュベートしてください。性的構造の生産を視覚的に評価する。 増殖速度実験を行い 、MAT 遺伝子の破壊が研究対象の菌の増殖速度に影響を及ぼしたかどうかを判断する。 巨大な無菌ピペットチップの裏側を寒天に挿入することで、突然変異型および野生型株の培養の積極的に成長するエッジから、骨髄で覆われた寒天プラグを作成します。 これらの寒天プラグで新鮮なMEA培地を接種します。各カルチャの種類ごとに少なくとも 3 つのレプリケートが作成されていることを確認します。 20°Cで3日間の成長の後、2つの垂直直径での成長を測定する。 野生型と変異株のデータを比較します。