Abordagem genética de frente de células vivas para identificar e isolar mutantes do desenvolvimento em trachomatis de clamídia

Clamídia trachomatis (Ctr) é um patógeno intracelular obrigatório que progride através de um ciclo de desenvolvimento bifásico que é essencial para sua sobrevivência e proliferação¹. Este ciclo consiste em duas formas de desenvolvimento, o corpo elementar (EB) e o corpo reticulado (RB). O EB é replicação incompetente, mas media a invasão celular através da endocitose induzida por efeito². Uma vez no host, o EB amadurece para o RB replicativo. O RB realiza várias rodadas de replicação antes de converter de volta para o EB, a fim de iniciar rodadas subsequentes de infecção.

A matriz limitada de ferramentas genéticas restringiu a maior parte da pesquisa clamídica a estudos bioquímicos ou ao uso de sistemas substitutos. Como consequência, a elucidação da regulação genética e o controle do ciclo de desenvolvimento tem sido difícil^3,4. Um dos desafios mais importantes no campo clamídico é o rastreamento temporal de alta resolução do ciclo de desenvolvimento clamídico e a identificação das proteínas envolvidas em sua regulação. A expressão genética durante o ciclo de desenvolvimento da clamídia tem sido tradicionalmente realizada por métodos destrutivos de “ponto final”, incluindo RNAseq, qPCR e microscopia celular fixa^5,,6. Embora esses métodos tenham fornecido informações inestimáveis, as técnicas empregadas são laboriosas e têm baixa resolução temporal^5,6.

Na última década, a manipulação genética da CTR progrediu com a introdução da transformação plasmida e dos métodos para mutagênese^7,,8,,9. Para este estudo, foi desenvolvido um sistema baseado em plasmídeos para monitorar o desenvolvimento clamídia em inclusões individuais em tempo real ao longo de uma infecção. Foi criado um transformador clamídial que expressou um promotor-repórter específico do tipo RB e EB. O repórter específico da RB foi construído fundindo o promotor do antigo gene RB euo upstream da proteína fluorescente Clover. EuO é um regulador transcricional que reprime um subconjunto de genes associados ao EB^{tardios 10}. O promotor do hctB, que codifica uma proteína semelhante a histona envolvida na condensação nucleóide EB, foi clonado diretamente a montante de mKate2 (RFP) para criar o repórter específico do EB¹¹. A espinha dorsal do hctBprom-mKate2/euoprom-Clover foi p2TK2SW2⁷. Os promotores hctB e euo foram amplificados a partir do DNA genômico Ctr-L2. Cada sequência de promotor consistia de ~100 pares base a montante do local de início de transcrição previsto para o gene clamídico especificado mais os primeiros 30 nucleotídeos (10 aminoácidos) do respectivo ORF. As variantes fluorescentes fp foram obtidas comercialmente como blocos genéticos otimizados pelo códon ctr e clonadas em quadro com os primeiros 30 nucleotídeos de cada gene e promotor clamídial. O exterminador incD foi clonado diretamente rio abaixo de mKate2. O segundo promotor-repórter foi inserido a jusante do exterminador do incD. O gene de resistência à ampicilina(bla) em p2TK2SW2 foi substituído pelo gene aadA (resistência à espectroicina) do pBam4. Isso resultou na construção final p2TK2-hctB prom-mKate2/euoprom-Clover (Figura 1A) que foi transformada em Ctr-L2⁷.hctB Esta cepa de repórter RB/EB permitiu a observação do ciclo de desenvolvimento dentro de inclusões únicas utilizando microscopia de células vivas (Figura 1B,C).

Empregando nossa construção promotor-repórter em combinação com mutagênese química, um protocolo foi criado para rastrear e isolar clones individuais que exibiam anormalidades no desenvolvimento de populações mutagenizadas de Ctr serovar L2. Este protocolo permite o monitoramento direto de inclusões croniaxias individuais, o rastreamento dos perfis de expressão genética ao longo do tempo, a identificação de clones clamídias que expressam um padrão de expressão genética de desenvolvimento alterado e isolamento clonal da Clamídia a partir de inclusões individuais.

Embora este protocolo tenha sido criado especificamente para a identificação de genes envolvidos no desenvolvimento clamídia, ele poderia ser facilmente adaptado para interrogar qualquer número de vias genéticas clamídias.